Bioteknologi Tanaman KULIAH V. PCR, Sekuensing. Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Transkripsi

1 Bioteknologi Tanaman KULIAH V PCR, Sekuensing Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

2 Copyright Statement: Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks, gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas lainnya) bahan kuliah dalam format.ppt sebagaimana tercantum disini memiliki hak eksklusif intelektual bagi penyusun. Penggunaan diluar untuk keperluan pembelajaran sebagaimana disepakati dalam pemberian material harus mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan pelanggaran dalam hal ini akan dikenakan sanksi hukum sebagaimana berlaku di Negara Kesatuan Republik Indonesia.

3 Bioteknologi Tanaman PCR (Polymerase Chain Reaction) Reaksi Berantai Polymerase Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

4 Bioteknologi Tanaman PCR PCR : Reaksi amplifikasi/penggandaan molekul DNA secara invitro dengan menggunakan bantuan enzim DNA-Polymerase Prinsip Kerja Mesin PCR: menyediakan kondisi reaksi optimal untuk terjadinya denaturasi ds-dna, pengikatan primer (annealing), dan ekstensi primer dengan menggunakan molekul dntps bebas melalui bantuan enzim DNA-Polymerase. Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

5 Bioteknologi Tanaman PCR Ditemukan oleh: Kary Mullis pada tahun (USA) Gambar: T-Gradient PCR produksi Biometra- Gmbh.-Jerman Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

6 Bioteknologi Tanaman PCR Taq-Polymerase ditemukan oleh: David Gelfant dan Susanne Stoffel Diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus. Prasyarat: 1. DNA Template, DNA yang akan diamplifikasi 2. Primer (Oligonukleotida), (8-35 basa nukleotid) (spesifik, arbitrary). 3. Enzim Taq-Polymerase, untuk mensintesis (memperpanjang rantai DNA dengan kecepatan 150 nukleotid/detik. 4. dntps (dctp, dgtp, dttp, datp), baik yang mixed atau single 5. MgCl2 Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

7 Bioteknologi Tanaman PCR Siklus 3 Siklus 2 Primer / Oligonukleotid Siklus 1 Templet Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

8 Bioteknologi Tanaman PCR Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

9 Bioteknologi Tanaman PCR Suhu Annealing Tm = ((G+C) x 4 C) + ((A + T) x 2 C). Contoh: CATAAGTCTGATACTTGCTG dimana: jumlah basa C = 4, G = 4, A = 5, T = 7, maka besarnya Tm adalah: Tm = ((4+4)x4) + ((5+7)x2) = = 56 C suhu annealing sekitar C Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

10 Test of designed specific primer Cg Gradient PCR

11 Bioteknologi Tanaman PCR Primer yang ideal : 1. Memiliki panjang sekitar nukleotid 2. Memiliki titik didih yang relatif tinggi 3. Sekuens primer hanya hadir satu kali pada templet DNA 4. Tidak berkomplementer dengan primer pasangannya 5. Tidak membentuk struktur sekunder dengan primer pasangannya 6. Memiliki proporsi GC dan AT yang seimbang 7. Primer pasangannya memiliki titik didih yang relatif sama Oligos V. 3.0 Universitas di Helsinki, Finlandia (Kalendar, 2002 ) Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

12 Bioteknologi Tanaman PCR Jumlah perbanyakan molekul DNA sintetis Dimana: X = 2 n X = Jumlah molekul yang dihasilkan setelah n siklus n = Jumlah siklus yang digunakan Contoh : Jika n = 30, maka jumlah molekul yang dihasilkan adalah: Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

13 Sekuensing Teknik identifikasi urutan nukleotida-nukleotida dari susunan DNA Diperkenalkan pada tahun 70-an oleh Maxam dan Gilbert, kemudian disusul oleh Sanger et al (Nobel, 80-an) Teknik Maxam dan Gilbert disamping sangat complicated juga banyak menggunakan bahan kimia yang toxic, karena itu teknik dari Sanger dianggap lebih efisien dan berkembang sampai saat ini

14 Prinsip Sekuensing Metode Sanger Chain termination method Menggunakan ddntps sebagai DNA chain terminator Komponen yang dibutuhkan: 1. single-stranded DNA template, 2. DNA primer, 3. DNA polymerase, 4. radioactively or fluorescently labeled nucleotides 5. modified nucleotides that terminate DNA strand elongation (ddntps) 6. dntps

15 Semi Automated Sekuensing 5 TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3 3 ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5 + TGCATTG 5 TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3 3 ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5 TGCATTG + Polymerase; da, dc, dg, dt, ddt 3 ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5 TGCATTGAAT 3 ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5 TGCATTGAATAT 3 ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5 TGCATTGAATAAGACGT dst 3 ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5 TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACT

16 Full Automated Sequencing (Dye-Terminator Sequencing) Sumber: Charoen Phokphand

17 Perbandingan penampilan antara sekuensing manual dengan sekuensing automatis Sumber: Charoen Phokphand

18 Contoh data sekuens dan elektrophoregram utk kontrol kualitas Tampilan Elektrophoregram dari sekuenser automatis

19 A B Megabace1000 produced by Amersham &Molecular- Dynamic.

20 Automated Sequencer ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). 4-Capillary Systems

21 Beckmann Coulter-Ge XP System

22 Sekuensing Elektrophoregram hasil pembacaan Megabace yang diolah dengan software DNAstar. DNA template berasal beet gula Sumber: Jamsari

23 Analisis Sekuens Gen databank (Genbank), DNA databank BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). BLASTn, BLASTp

24 SELESAI