AKTIVITAS ANTIVIRAL [6]-GINGEROL TERHADAP VIRUS DENGUE STUDI EKSPERIMENTAL IN VITRO PADA GALUR SEL A549

Transkripsi

1 AKTIVITAS ANTIVIRAL [6]-GINGEROL TERHADAP VIRUS DENGUE STUDI EKSPERIMENTAL IN VITRO PADA GALUR SEL A549 Stefanie Natalia Halim 1, Edi Dharmana 2, Rebriarina Hapsari 3 1 Mahasiswa Program Studi S-1 Ilmu Kedokteran Umum, Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro 2 Staf Pengajar Ilmu Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro 3 Staf Pengajar Ilmu Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro JL. Prof. H. Soedarto, SH., Tembalang-Semarang 5275, Telp ABSTRAK Latar belakang : Virus dengue (DENV) adalah arbovirus yang paling luas tersebar secara geografis. Sampai sekarang belum ada obat antivirus berlisensi yang terbukti efektif untuk menangani kasus infeksi DENV. Akibatnya, pengobatan infeksi DENV saat ini hanya terbatas pada deteksi dini, penggantian cairan, dan terapi simtomatik. Jahe merupakan salah satu jenis tanaman obat yang telah lama dikenal di Indonesia. Gingerol adalah kandungan minyak non volatile utama dari jahe segar, dengan kandungan terbanyak adalah [6]-gingerol. [6]-gingerol mempunyai efek inhibisi pada biosintesis asam lemak yang sangat berperan dalam replikasi virus dengue. Tujuan : Penelitian ini meneliti pengaruh antivirus dari [6]-gingerol, konstituen aktif utama jahe (Zingiber officinale) pada pertumbuhan DENV pada galur sel A549. Metode : Awalnya, dilakukan cell toxicity assay [6]-gingerol pada galur sel A549 untuk menentukan CC 5 [6]-gingerol. Kemudian, sel-sel diinfeksi dengan DENV-1 pada multiplisitas infeksi = 1 dan dilakukan perlakuan dengan dosis multi-subtoksik dari [6]- gingerol selama masa inkubasi penuh (full time) dan setelah virus masuk ke sel-sel (after entry). Sel yang terinfeksi diinkubasi dengan [6]-gingerol selama 48 jam. Terakhir, titer virus ditentukan menggunakan plaque assay. Hasil : Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian [6]-gingerol pada galur sel A549 yang terinfeksi DENV secara signifikan dapat mengurangi virus titer baik perlakuan full time maupun after entry, IC 5 =,32 mm pada after entry dan IC 5 =,38 mm pada full time. Dengan demikian [6]-gingerol memiliki kemampuan antiviral untuk mengurangi pertumbuhan DENV melalui penghambatan replikasi. Kesimpulan : [6]-gingerol memiliki aktivitas antivirus potensial terhadap infeksi DENV dan dapat memberikan pendekatan terapi baru untuk infeksi DENV. Kata kunci : Dengue, [6]-Gingerol, galur sel A549 ABSTRACT Background : Dengue virus (DENV) is the most geographically widespread arbovirus and a major worldwide public health problem. Until now, there is no licensed antiviral drug available. Consequently, the current treatment for DENV infection is only limited to early detection, fluid replacement, and symptomatic therapy. Therefore antiviral drug should be more effective treatment. Ginger is one of the medicinal plants that have long been known in Indonesia. Gingerol is the main non volatile oil content of fresh ginger. The highest content is [6]-gingerol, which have inhibitory effects on fatty acid biosynthesis is important in dengue virus replication. Aims : In this study, we investigated the antiviral effect of [6]-gingerol, a major active constituent of ginger (Zingiber officinale), on DENV growth in human lung epithelial carcinoma (A549) cells line. 1217

2 Methods : Initially, we conducted [6]-gingerol A549 cells toxicity assay to determine [6]- gingerol s Cytotoxic Dose (CC5) in A549 cells. Then, we infected the cells with DENV-1 at multiplicity of infection = 1 and treated the cells with multi-subtoxic dose of [6]-Gingerol during whole incubation (Full Time) and after the virus entry to the cells (After Entry). We incubated the infected cells with [6]-gingerol for 48 H and latter, determined virus titer using plaque assay. Results : Treatment of DENV infected cells with [6]-gingerol could significantly reduce virus titer in both full time and after entry treatment with IC5 =.32 mm on After Entry treatment and IC5 =.38 mm on Full Time treatment. These results indicate [6]-gingerol has the antiviral ability to reduce DENV growth through replication inhibition. Conclusion : [6]-gingerol has a potential antiviral activity against DENV infection and could provide a new therapeutic approach for DENV infection. Keyword: Dengue, [6]-Gingerol, A549 cell PENDAHULUAN Virus dengue (DENV) adalah penyebab paling umum dari penyakit arboviral. Menurut World Health Organization (WHO), virus dengue merupakan mosquito-borne viral disease yang paling cepat penyebarannya di dunia, yang memberikan kontribusi sekitar 5 juta infeksi setiap tahunnya dan mempengaruhi lebih dari 2,5 miliar penduduk yang tinggal di daerah yang berpotensi beresiko untuk demam berdarah. Sebelum tahun 197, hanya terdapat 9 negara yang mengalami epidemi dengue tingkat yang menghawatirkan, namun sekarang lebih dari 1 negara yang mengalami permasalahan dengue denga tahap yang lebih serius. Setiap tahunnya terdapat sekitar 5. orang yang terinfeksi virus dengue harus mendapatkan perawatan yang intensif. 1 Di Indonesia, dengue merupakan penyakit yang banyak di jumpai dengan case-fatality rates yang tinggi. 2 Sekitar 2,5% dari total penderita virus dengue meninggal dunia. 1 Terhitung sejak tahun , WHO mencatat Indonesia sebagai negara dengan kasus demam berdarah dengue (DBD) tertinggi di Asia Tenggara. 3 Pada tahun 214, bulan Januari hingga pertengahan bulan Desember tercatat sebanyak kasus DBD di Indonesia, dengan 641 kasus di antaranya meninggal dunia. Namun angka ini telah mengalami penurunan dibandingkan dengan kasus yang tercatat di tahun 213, terdapat kasus DBD dengan 871 kasus di antaranya meninggal dunia. 4 DENV adalah virus RNA anggota genus Flavivirus dalam famili Flaviviridae. Ada empat serotipe virus dengue, yaitu DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, 5 dan DENV-5. 6 Tahun 29, klasifikasi kasus dengue mengalami perubahan. WHO mengklasifikasikan dengue sesuai dengan tingkat keparahan: dengue tanpa warning signs, dengue dengan warning signs, dan severe dengue. Klasifikasi 29 ini dianggap lebih sensitif dalam mengklasifikasikan kasus infeksi dengue. 7 Sampai sekarang belum ada obat antivirus 1218

3 berlisensi yang terbukti efektif untuk menangani kasus infeksi DENV. Akibatnya, pengobatan infeksi DENV saat ini hanya terbatas pada deteksi dini, penggantian cairan, dan terapi simtomatik. Adanya kecenderungan masyarakat yang memilih obat herbal daripada obat sintetik dengan alasan bahwa alami lebih sehat dan harga lebih terjangkau 8, membuat tanaman obat banyak diteliti. Jahe merupakan salah satu jenis tanaman obat yang telah lama dikenal di Indonesia. Hampir semua wilayah di Indonesia, kecuali Maluku Utara, membudidayakan jahe. 9 Kandungan utama dari jahe (Zingiber officinale) adalah [6]-gingerdiol, [6]-gingerol, dan [1]-gingerol. 1 Gingerol adalah kandungan minyak non volatile utama dari jahe segar, dengan kandungan terbanyak adalah [6]-gingerol. 11 [6]-gingerol mempunyai efek inhibisi pada biosintesis asam lemak yang sangat berperan dalam replikasi virus dengue. 12 Diketahui bahwa jahe segar terbukti menghambat proses attachment dan internalisasi dari Human Respiratory Syncytial Virus (hrsv). 13 Efek antiviral jahe segar juga didapatkan pada jenis virus lain, yaitu virus Hepatitis C (HCV). HCV merupakan anggota dari Hepacivirus dalam famili yang sama dengan DENV, yaitu famili Flaviviridae. 5 Lyophilizied juice dari jahe (Zingiber officinale) dapat menghambat replikasi dari HCV. Penghambatan replikasi HCV ini melalui penghambatan NS3 protease. Protein ini juga terdapat pada DENV, anggota dari genus Flavivirus dan hampir seluruh replikasi Flavivirus melibatkan protein nonstruktural ini. 1 Pada penelitian ini hanya dilihat efek [6]-gingerol pada DENV-1 karena pada tahun 215 muncul outbreak infeksi virus dengue di Jambi. Pada outbreak tersebut diketahui bawa DENV-1 adalah serotipe yang mendominasi terjadinya outbreak. 14 Metode yang digunakan dalam peneltian ini adalah kultur sel dan plaque assay. Replikasi DENV paling efisien terjadi pada galur sel C6/36, Vero, dan A549. Pada penelitian ini sel yang digunakan adalah galur sel A549 (adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells). Terlepas dari fakta bahwa galur sel A549 berasal dari sel epitel, infeksi beberapa galur sel manusia dengan DENV-2 menunjukkan keunggulan galur sel A549 untuk mendukung replikasi DENV dibandingkan galur sel lain. 15 Selain itu pada galur sel A549 terdeteksi antigen viral di makrofag dan di sel endotel pembuluh darah pada jaringan paru. 16 Plaque assay adalah prosedur untuk mengetahui kuantitas virus yang infeksius. 17 Plaque yang terbentuk berupa area berwarna lebih gelap yang mengeliling sel. Plaque ini adalah hasil dari cytopathic effect (CPE) yang ditimbulkan oleh virus. Satuan yang digunakan 1219

4 Viabilitas Sel (%) JURNAL KEDOKTERAN DIPONEGORO untuk menghitung sejumlah virus yang menimbulkan plaque adalah plaque-forming unit (PFU). 18 METODE Penelitian ini dilakukan secara eksperimental in vitro menggunakan galur sel A549. Serotipe DENV yang digunakan adalah DENV-1. Awalnya, dilakukan cell toxicity assay [6]- gingerol pada galur sel A549 untuk menentukan CC 5 [6]-gingerol. Kemudian, sel-sel diinfeksi dengan DENV-1 pada multiplisitas infeksi = 1 dan dilakukan perlakuan dengan dosis multi-subtoksik dari [6]-gingerol selama masa inkubasi penuh (full time) dan setelah virus masuk ke sel-sel (after entry). Sel yang terinfeksi diinkubasi dengan [6]-gingerol selama 48 jam. Terakhir, titer virus ditentukan menggunakan plaque assay. HASIL Cell Toxicity Assay [6]-Gingerol terhadap Galur Sel A549 DMSO,1% (vehicle) sebagai pelarut [6]-gingerol tidak mempengaruhi viabilitas sel dibandingkan terhadap kontrol (galur sel A549 + medium). CC 5 [6]-gingerol pada durasi inkubasi 24 jam adalah,34 mm dan pada durasi inkubasi 48 jam adalah,21 mm Jam 48 Jam 5 Medium only Vehicle,1%,5 mm,1 mm,2 mm,4 mm,5 mm Gambar 1 Hasil Cell Toxicity Assay 122

5 Viabilitas Sel (%) Viabilitas Sel (%) JURNAL KEDOKTERAN DIPONEGORO Y = -13.6*X (A) Y = *X (B) Gambar 2 Grafik Cell Toxicity Assay pada durasi inkubasi (A) 24 Jam (B) 48 Jam Viabilitas Galur Sel A549 setelah Perlakuan After Entry dan Full Time Hasil MTT assay memperlihatkan terjadinya penurunan viabilitas sel pada kontrol (galur sel A549 + medium + DENV-1). Penurunan viabilitas sel juga terjadi pada perlakuan after entry dan full time (p<,1), terutama pada konsentrasi [6]-gingerol,2 mm. Namun pada konsentrasi [6]-gingerol,5 mm (post-hoc Tukey s multiple comparisons test) penurunan viabilitas sel tidak signifikan. Ini berarti viabiltas sel A549 tidak terpengaruhi pada konsentrasi [6]-gingerol,5 mm. 1221

6 Titer Virus (Log of PFU/ml) Viabilitas Sel (%) JURNAL KEDOKTERAN DIPONEGORO 15 1 Kontrol After Entry Full Time 5 Medium only Vehicle,1%.5 mm.1 mm.2 mm Gambar 3 Viabilitas sel setelah perlakuan after entry dan full time menunjukkan bahwa pemberian [6]-gingerol mempengaruhi viabilitas sel A549, terlihat dari grafik after entry dan full time yang mengalami penurunan. Pengukuran Titer Virus Setelah Perlakuan After Entry dan Full Time Dari hasil plaque assay, terdapat penurunan titer virus seiring dengan kenaikan konsentrasi [6]-gingerol (p<,1). IC 5 [6]-gingerol pada perlakuan after entry dan full time adalah,32 mm dan,38 mm. 8 6 After Entry Full Time 4 2 Virus only Vehicle,1%.5 mm.1 mm.2 mm Gambar 4 Hasil plaque assay setelah perlakuan after entry dan full time menunjukkan penurunan titer virus seiring dengan penambahan konsentrasi [6]-gingerol. 1222

7 *** ** *** *** (A) P value ** = <,1 *** = <,1 = <,1 (B) Gambar 5 Uji One-Way ANOVA titer virus setelah perlakuan (A) after entry dan (B) full time 1223

8 Titer Virus (%) Titer Virus (%) Titer Virus (%) JURNAL KEDOKTERAN DIPONEGORO (A) 15 1 After Entry Full Time (B) Y = -41.3*X (C) Y = *X Gambar 6 Grafik pengaruh perlakuan (A) after entry dan full time (B) after entry (C) full time terhadap titer virus menunjukkan bahwa titer virus lebih mengalami penurunan pada perlakuan after entry daripada full time. DISKUSI Senyawa [6]-gingerol merupakan suatu zat kimia yang banyak ditemukan pada jahe (Zingiber officinale). Kadar subtoksik [6]-gingerol supaya galur sel A549 tidak mati karena efek dari [6]-gingerol ditentukan terlebih daluhu sebelum melakukan perlakuan. Hasil dari penelitian ini menunjukkan CC 5 [6]-gingerol terhadap galur sel A549 pada durasi inkubasi 24 jam dan 48 jam adalah,34 mm dan,21 mm. Diketahui dari penelitian lain, CC 5 [6]- 1224

9 gingerol terhadap galur sel HepG2 pada durasi inkubasi 24 jam dan 48 jam adalah,56 mm dan,42 mm. 12 terhadap galur sel HepG2. CC 5 [6]-gingerol terhadap galur sel A549 lebih rendah dibandingkan Viabilitas sel A549 terpengaruhi dengan pemberian berbagai konsentrasi [6]-gingerol, terutama pada konsentrasi,2 mm (gambar 15). Hasil tidak sesuai dengan hipotesis. Hal ini dimungkinkan karena konsentrasi [6]-gingerol yang digunakan dalam penelitian ini sangat dekat dengan CC 5 [6]-gingerol,,34 mm (24 jam) dan,21 mm (48 jam). Padahal IC 5 [6]- gingerol hanya sebesar,32 mm pada perlakuan after entry dan,38 mm pada perlakuan full time. Namun demikian, penurunan titer virus pada penelitian ini bukan dikarenakan kematian sel akibat [6]-gingerol, melainkan karena pengaruh kemampuan antiviral [6]- gingerol. Dari data post-hoc Tukey s multiple comparisons test, penurunan viabilitas sel pada konsentrasi [6]-gingerol,5 mm tidak signifikan, baik pada perlakuan after entry maupun full time. Ini menandakan bahwa konsentrasi [6]-gingerol,5 mm tidak mempengaruhi viabilitas sel. Penurunan viabiltas sel pada grafik kontrol dikarenakan sifat CPE virus yang membuat viabilitas sel akan menurun tanpa perlakuan apapun. Kandungan [6]-gingerol pada jahe (Zingiber officinale) mempunyai aktivitas antiviral virus dengue pada kultur galur sel A549 yang diinfeksikan DENV. Hasil menunjukkan bahwa dengan penambahan [6]-gingerol, titer virus mengalami penurunan (gambar 16). After entry melihat kerja [6]-gingerol pada penghambatan replikasi DENV. Full time melihat kerja [6]-gingerol pada proses perlekatan DENV. Hasil menunjukkan bahwa perlakuan pada after entry mengalami penurunan titer virus yang lebih dari perlakuan full time. IC 5 [6]-gingerol terhadap galur sel A549 pada perlakuan after entry dan full time adalah,32 mm dan,38 mm. Pada konsentrasi,5 mm [6]-gingerol didapatkan penurunan titer virus yang lebih pada perlakuan after entry dibandingkan pada perlakuan full time. Ini menunjukkan bahwa [6]-gingerol dapat menghambat virus baik sebelum virus masuk ke dalam sel atau setelah virus masuk ke dalam sel, tetapi [6]-gingerol cenderung lebih menghambat virus pada proses replikasinya (setelah virus masuk ke dalam sel). Penelitian mengenai pengaruh jahe segar pada hrsv menunjukkan bahwa jahe segar lebih efektif bekerja sebelum inokulasi virus pada galur sel A Terjadi perbedaan letak keefektifan kerja kemungkinan dikarenakan variabel bebas yang digunakan pada penelitian ini adalah senyawa yang dominan pada jahe segar, yaitu [6]-gingerol bukan jahe segar. Penelitian ini juga melihat pengaruhnya pada DENV bukan pada hrsv. 1225

10 Kelemahan penelitian ini adalah hanya melihat pengaruh [6]-gingerol pada DENV-1, tidak pada semua serotipe. Hal ini dikarenakan keterbatasan waktu peneliti. Selain itu, setelah ditemukan CC 5 [6]-gingerol peneliti tidak melakukan uji one way ANOVA terlebih dahulu sehingga tidak diketahui bahwa pada konsentrasi [6]-gingerol,1 mm dan,2 mm didapatkan penurunan viabilitas sel A549 yang signifikan sehingga selanjutnya perlu diteliti mengapa pada konsentrasi tersebut terdapat penurunan viabilitas sel yang signifikan. Penelitian ini hanya menunjukkan hasil bahwa [6]-gingerol cenderung lebih efektif menghambat DENV pada proses replikasinya, namun tidak melihat secara spesifik letak kerja dari [6]-gingerol dalam menghambat virus. Maka sebaiknya perlu dinilai juga kadar FASN pada galur sel A549 untuk mengetahui pengaruh [6]-gingerol pada kadar FASN galur sel A549. Penelitian ini dilakukan in vitro sehingga pengaruh [6]-gingerol pada manusia belum tentu sama. Akan lebih baik bila penelitian dilakukan in vivo pada tikus AG129 agar lebih mendekati terapi adjuvan infeksi virus dengue. KESIMPULAN CC 5 [6]-gingerol terhadap galur sel A549 pada durasi inkubasi 24 jam dan 48 jam adalah,34 mm dan,21 mm. Titer virus pada galur sel A549 yang digunakan pada infeksi virus dengue mengalami penurunan seiring dengan penambahan konsentrasi [6]-gingerol. IC 5 [6]-gingerol terhadap galur sel A549 pada perlakuan after entry dan full time adalah,32 mm dan,38 mm. DAFTAR PUSTAKA 1. WHO. Dengue and Severe Dengue. WHO; 215 [updated May 215]; Available from: 2. WHO. Dengue: Guidelines For Diagnosis, Treatment, Prevention, and Control Umar Fahmi Achmadi PS, Supratman Sukowati, Tri Yunis Miko Wahyono, Budi Haryanto, Sigit Mulyono, dan Andrio Adiwibowo. Demam Berdarah Dengue. Buletin Jendela Epidemiologi. 21; Indonesia KKR. Demam Berdarah Biasanya Mulai Meningkat di Januari. 215; Available from: 5. Levinson W. Review of Medical Microbiology & Immunology, Eleventh Edition. United States of America: The McGraw-Hill Companies, Inc.;

11 6. Lt Col M.S. Mustafa CVR, Col S. Jain, Lt Col V. Gupta. Discovery of fifth serotype of dengue virus (DENV-5): A new public health dilemma in dengue control. Medical Journal Armed Forces India. 214; Hadinegoro SRS. The Revised Who Dengue Case Classification: Does The System Need To Be Modified? Paediatrics and International Child Health. 212; WHO. WHO Traditional Medicine Strategy : Pribadi ER. Usahatani Dan Pemasaran Jahe. Status Teknologi Hasil Penelitian Jahe. 1. Hala El-Adawi ME-DaAAE-W. Some Medicinal Plant Extracts Exhibit Potency Against Viral Hepatitis C. Journal of Bioscience And Technology. 211; Suzanna M. Zick ZD, Mack T. Ruffin, Amie J. Litzinger, Daniel P. Normolle, Sara Alrawi, Meihua Rose Feng, and Dean E. Brenner. Pharmacokinetics of 6-Gingerol, 8- Gingerol, 1-Gingerol, and 6-Shogaol and Conjugate Metabolites in HealthyHumanSubjects. Cancer Epidemiol Biomarkers Hathaichanok Impheng LR, Dumrongsak Pekthong, C Norman Scholfield, Sutatip Pongcharoen, Ittipon Pungpetchara, Piyarat Srisawang. [6]-Gingerol Inhibits De Novo Fatty Acid Synthesis and Carnitine Palmitoyltransferase-1 Activity which Triggers Apoptosis in Hepg2. Am J Cancer Res. 215; 5: Jung San Chang KCW, Chia Feng Yeh, Den En Shieh, Lien Chai Chiang. Fresh ginger (Zingiber officinale) has anti-viral activity against human respiratory syncytial virus in human respiratory tract cell lines. Journal of Ethnopharmacology Sotianingsih Haryanto RFH, Benediktus Yohan, Lanceria Sijabat, Ifo F. Sihite, Sukmal Fahri, Febrina Meutiawati, Jonathan A.N. Halim, Stefanie N. Halim, Amin Soebandrio, R. Tedjo Sasmono. The Molecular and Clinical Features of Dengue During Outbreak In Jambi, Indonesia In 215. Pathogens and Global Health B. Yohan RIK, K. Mutia, A. Bowolaksono, A. R. Harahap, R. Tedjo Sasmono. Growth Characteristics and Cytokine/Chemokine Induction Profiles of Dengue Viruses in Various Cell Lines. Acta virologica. 214; 58: Kala Jessie MYF, Shamala Devi, Sai Kit Lam, and K. Thong Wong. Localization of Dengue Virus in Naturally Infected Human Tissues, by Immunohistochemistry and In Situ Hybridization. The Journal of Infectious Diseases. 24; 189: Racaniello V. Detecting Viruses: The Plaque Assay. 29; Available from: Virapur. Virus Plaque Assay Protocol: Available from: Plaque Assay Protocol.pdf. 1227