GAMBARAN IMUNOHISTOKIMIA ANTIOKSIDAN SUPEROKSIDA DISMUTASE PADA JARINGAN HATI TIKUS DIABETES MELLITUS YANG DIBERI VIRGIN COCONUT OIL (VCO)

Transkripsi

1 GAMBARAN IMUNOHISTOKIMIA ANTIOKSIDAN SUPEROKSIDA DISMUTASE PADA JARINGAN HATI TIKUS DIABETES MELLITUS YANG DIBERI VIRGIN COCONUT OIL (VCO) SERINA HANARYA DJAJAKIRANA FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009

2 ABSTRAK SERINA HANARYA DJAJAKIRANA. Gambaran Imunohistokimia Antioksidan Superoksida Dismutase pada Jaringan Hati Tikus Diabetes Mellitus yang diberi Virgin Coconut Oil (VCO). Dibimbing oleh TUTIK WRESDIYATI Virgin coconut oil atau minyak kelapa murni saat ini umum digunakan antara lain untuk pengobatan beberapa penyakit. Secara empiris dilaporkan, minyak kelapa murni bermanfaat dalam menurunkan kadar glukosa darah. Penelitian ini bertujuan untuk melihat pengaruh pemberian minyak kelapa murni/vco terhadap profil antioksidan intraseluler copper,zinc-superoxide dismutase (Cu, Zn-SOD) pada jaringan hati tikus diabetes mellitus. Kondisi diabetes mellitus didapat dengan cara induksi alloxan yang dapat merusak sel β Pulau Langerhans. Sebanyak 25 ekor tikus jantan galur Sprague dawley dikelompokkan menjadi 5 kelompok, yaitu (1) kelompok kontrol negatif (K-), (2) kelompok kontrol positif/diabetes (K+), (3) kelompok diabetes dengan pemberian VCO A (VA), (4) kelompok diabetes dengan pemberian VCO B (VB), (5) kelompok diabetes dengan pemberian minyak goreng (MG). Dosis aquadest, VCO, dan minyak goreng yang diberikan 5ml/ekor/hari selama 28 hari. Jaringan hati diambil di akhir perlakuan lalu diproses dengan metode embedding paraffin. Potongan jaringan hati diwarnai dengan Hematoxylin Eosin (HE) dan imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD. Pemberian VCO menunjukkan gambaran morfologi hati yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok kontrol positif dan kelompok minyak goreng. Pemberian VCO dapat meningkatkan kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus diabetes mellitus dibandingkan dengan kelompok kontrol positif dan minyak goreng. Pemberian VCO A menunjukkan profil antioksidan Cu,Zn-SOD yang lebih baik dibandingkan kelompok perlakuan VCO B.

3 GAMBARAN IMUNOHISTOKIMIA ANTIOKSIDAN SUPEROKSIDA DISMUTASE PADA JARINGAN HATI TIKUS DIABETES MELLITUS YANG DIBERI VIRGIN COCONUT OIL (VCO) SERINA HANARYA DJAJAKIRANA Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan Pada Fakultas Kedokteran Hewan FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009

4 Judul Skripsi Nama Mahasiswa Nomor Pokok : Gambaran Imunohistokimia Antioksidan Superoksida Dismutase pada Jaringan Hati Tikus Diabetes Mellitus yang diberi Virgin Coconut Oil (VCO) : Serina Hanarya Djajakirana : B Telah diperiksa dan disetujui Oleh Pembimbing drh. Tutik Wresdiyati, Ph.D NIP: Mengetahui, Wakil Dekan Dra. Nastiti Kusumorini NIP:

5 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor, Jawa Barat pada tanggal 24 Juli 1985, sebagai anak perempuan tertua dari tiga bersaudara pasangan Gunawan Djajakirana dan Septiana Ismantyo. Pendidikan Sekolah Dasar ditempuh penulis di SD Budi Mulia Bogor ( ), SLTP Budi Mulia Bogor ( ), kemudian SMU Budi Mulia Bogor ( ). Penulis diterima di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor pada tahun 2004 melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Selama menjadi mahasiswa penulis menjadi anggota di Himpunan Minat Hewan Kesayangan dan Satwa Akuatik.

6 KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa untuk segala hal baik dan berkat yang telah dikaruniakan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul Gambaran Imunohistokimia Antioksidan Superoksida Dismutase pada Jaringan Hati Tikus Diabetes Mellitus yang diberi Virgin Coconut Oil (VCO). Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih yang tulus kepada: 1. drh. Tutik Wresdiyati, Ph.D selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan pengarahan selama penelitian berlangsung hingga akhir penulisan skripsi ini. 2. Dr. drh. Damiana R. Ekastuti selaku dosen penguji yang telah memberikan banyak masukan bagi penulis. 3. Pak Dadang Supriatna atas kerja sama dan bantuan selama melakukan penelitian di laboratorium hewan percobaan SEAFAST Center. 4. Dr. drh. Adi Winarto, drh I Ketut Mudite Adyane, MSi serta Pak Maman yang membantu penulis selama melakukan penelitian di laboratorium Histologi. 5. drh Rr. Soesatyoratih selaku dosen pembimbing akademik atas bimbingannya selama penulis melakukan studi di Fakultas Kedokteran Hewan. 6. Papa dan Mama, Stephen, Stephanie, dan Remy atas doa, kasih sayang, perhatian dan dukungannya sehingga menjadi kekuatan, semangat, dan kebahagiaan bagi penulis. 7. Sahabat-sahabatku: Resty, Piping, Ci Rita, Tante Erna, Hendra atas kesediaannya menjadi tempat curahan hati, teman seperjuangan, dan tempat berbagi suka-duka. 8. Teman-teman: Dika, Adit, Amoy, Novi, Oki, Bagus, Heryu, Janto dan juga seluruh Asteroidea 41 atas kebersamaan yang indah selama empat tahun ini.

7 . 9. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan menjadi berkat bagi banyak pihak yang membacanya. Bogor, November 2008 Serina Hanarya Djajakirana

8 DAFTAR ISI DAFTAR ISI vi DAFTAR TABEL. vii DAFTAR GAMBAR viii DAFTAR LAMPIRAN. ix PENDAHULUAN. 1 Latar Belakang 1 Tujuan Penelitian. 2 TINJAUAN PUSTAKA. 3 Organ Hati... 3 Alloxan... 4 Diabetes Mellitus. 4 Superoksida Dismutase (SOD). 6 Virgin Coconut Oil (VCO).. 6 METODE PENELITIAN 8 Waktu dan Tempat Penelitian.. 8 Materi Penelitian.. 8 Metode Penelitian 8 Pembuatan Tikus Diabetes Mellitus 8 Persiapan Hewan Coba 8 Pewarnaan Hematoxylin Eosin 9 Pewarnaan Imunohistokimia Parameter. 10 Analisis Data 10 HASIL.. 11 Morfologi Hati.. 11 Profil Cu,Zn-SOD. 11 PEMBAHASAN.. 18 Morfologi Hati.. 18 Profil Cu,Zn-SOD. 19 KESIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA 23 LAMPIRAN.. 25

9 DAFTAR TABEL Halaman 1. Rata-rata jumlah inti sel hati yang bereaksi pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus perlakuan perlapang pandang pada pembesaran 40x. 12

10 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Fotomikrograf jaringan hati tikus perlakuan pewarnaan Hematoxylin Eosin Fotomikrograf jaringan hati tikus perlakuan pewarnaan Imunohistokimia Cu,Zn-SOD Persentase jumlah inti sel hati yang bereaksi positif dan negatif terhadap Cu,Zn-SOD. 16

11 DAFTAR LAMPIRAN 1. Proses Preparasi Jaringan. 26 Halaman 2. Proses Pewarnaan Hematoxylin eosin (HE) Prosedur Pewarnaan Imunohistokimia terhadap Cu,Zn- SOD Analisis Sidik Ragam (ANOVA) dengan uji lanjutan Duncan yang memberikan reaksi positif kuat, positif sedang, positif lemah, dan negatif terhadap kandungan Cu,Zn-SOD. 29

12 PENDAHULUAN Latar Belakang Penderita kencing manis (diabetes mellitus) dari tahun ke tahun semakin meningkat. Saat ini diperkirakan 45% dari jumlah penduduk dunia sangat berisiko terserang penyakit diabetes (Rindengan dan Novarianto 2005). Dengan perubahan pola hidup dan pola makan, jumlah penderita diabetes di Indonesia semakin meningkat. Indonesia sendiri merupakan negara urutan keempat dengan penderita penyakit kencing manis terbanyak. Diabetes mellitus sendiri adalah suatu kelainan metabolisme ditandai dengan hiperglikemia, defisiensi sekresi insulin, resistensi insulin, atau bahkan keduanya (Gardner dan Shoback 2007). Kekurangan insulin, menyebabkan otot, lemak, serta sel hati tidak dapat mengambil glukosa dari darah ke bagian intraseluler. Terjadinya kelaparan pada intraseluler menyebabkan sel mencari sumber energi lain, yaitu lemak (Chausmer 1998). Proses pemecahan lemak, selain menghasilkan energi juga menghasilkan produk sampingan, yaitu radikal bebas. Radikal bebas adalah produk antara yang terbentuk dalam berbagai proses reaksi dari metabolisme sel. Radikal bebas adalah suatu atom, gugus atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbital paling luarnya. Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan radikal bebas secara kimiawi sangat reaktif. Substansi ini mampu merusak berbagai komponen sel sehingga dapat menyebabkan kerusakan bahkan kematian sel dan berbagai kelainan tubuh. Meskipun demikian, fisiologi normal tubuh memiliki mekanisme proteksi terhadap efek radikal bebas dengan adanya enzimenzim dan antioksidan (Gitawati 1995). Antioksidan adalah suatu zat yang dapat menetralisir radikal bebas atau kerja radikal bebas dan dapat bekerja pada tahap-tahap yang berbeda. Antioksidan sebagai sistem perlindungan tubuh dapat dibedakan atas antioksidan eksogen yang diperoleh dari bahan makanan seperti askorbat, tokoferol, karoten, dan lain-lain serta antioksidan endogen yang terdiri dari enzim-enzim yang disintesis tubuh seperti superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase (Devasagayam et al. 2004).

13 Superoksida dismutase (SOD) adalah enzim yang mengkatalase dismutasi superoksida radikal (O - 2 ) menjadi oksigen (O 2 ) dan hidrogen peroksida (H 2 O 2 ). Senyawa hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) masih berbahaya sehingga enzim katalase berfungsi memecah H 2 O 2 menjadi air (Devasagayam et al. 2004). Copper,zincsuperoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) adalah salah satu jenis SOD yang paling stabil karena tiap sub unit tergabung oleh ikatan non-kovalen dan terangkai oleh ikatan sulfida. Enzim ini memiliki peranan penting dalam pertahanan tubuh melawan radikal bebas O - 2. Telah dilaporkan oleh Wresdiyati et al. (2003) bahwa Cu,Zn-SOD menurun pada jaringan hati Macaca fascicularis diabetes mellitus. Minyak kelapa murni atau lebih dikenal dengan Virgin Coconut Oil (VCO) dilaporkan secara empiris memiliki berbagai manfaat antara lain untuk komestika dan untuk pengobatan penyakit. Minyak kelapa murni juga dipercaya dapat mencegah serta mengobati berbagai macam penyakit, antara lain kanker, hepatitis, penyakit jantung, diabetes, dan lain-lain. Penderita diabetes mellitus dianjurkan mengkonsumsi minyak kelapa murni (VCO) karena dapat membantu menstabilkan kadar glukosa darah (Rindengan dan Novarianto 2005). Tetapi secara ilmiah, khasiat minyak kelapa murni ini belum banyak dilaporkan, terutama pengaruhnya terhadap kandungan antioksidan superoksida dismutase (SOD) pada jaringan hati tikus diabetes mellitus. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk melihat pengaruh pemberian minyak kelapa murni (VCO) terhadap profil antioksidan copper,zinc-superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) pada jaringan hati tikus dalam kondisi diabetes mellitus.

14 TINJAUAN PUSTAKA Organ Hati Hati adalah organ terbesar dalam tubuh, yaitu sekitar 2.5% dari berat badan orang dewasa (Rodney dan Tanner 2004). Hati terletak di rongga perut sebelah kanan, tepat di bawah diafragma dan berwarna coklat kemerahan. Suplai darah ke organ hati didapat dari dua pembuluh darah, antara lain vena porta yang membawa darah dari lambung, usus, dan limpa yang terdiri dari berbagai hasil digesti dan sejumlah sel darah putih. Sedangkan, arteri hepatika membawa darah yang kaya oksigen untuk sel-sel hati (Dellman dan Eurell 1998). Hati tikus terletak sangat dekat dengan tulang rusuk. Hati tikus terdiri dari empat lobus, yaitu lateral kiri, lateral kanan, medial dan lobus kanan. Permukaan viscera berdekatan dengan lambung, duodenum, colon, jejunum dan pankreas. Tikus tidak memiliki kantung empedu. Saluran empedu bersatu membentuk saluran hati (hepatic duct) yang melewati pankreas. Cairan empedu dan pankreas akan masuk melalui suatu saluran umum yang kemudian masuk ke proksimal dari duodenum yang letaknya berdekatan dengan pilorus (O Malley 2005). Unit fungsional dasar hati adalah lobulus hati, yang berbentuk silindris dengan panjang beberapa milimeter dan berdiameter 0,8 sampai 2 milimeter. Lobulus sendiri dibentuk dari banyak sel hati. Ruangan di antara sel hati disebut sinusoid. Sinusoid dilapisi oleh sel endotel dan sel Kupffer yang merupakan makrofag jaringan yang dapat memfagositosis bakteri dan benda asing dalam darah. Di antara sel endotel dan sel hati terdapat ruang yang sangat sempit yaitu ruang Disse yang menghubungkan pembuluh limfe di dalam septum interlobularis (Guyton dan Hall 1997). Hati mempunyai banyak fungsi fisiologis dalam tubuh, yakni sebagai tempat metabolisme karbohidrat, protein dan lemak, detoksifikasi racun, tempat pembentukkan sel darah merah serta penyaring darah dan berperan dalam penggumpalan darah, menghasilkan empedu, dan sebagai tempat penyimpanan vitamin dan zat besi (Guyton dan Hall 1997).

15 Alloxan Alloxan berbentuk kristal, berwarna putih, dan mudah larut dalam air. Dalam bentuk larutan, apabila terkena kulit alloxan akan berubah warna menjadi merah. Alloxan digunakan antara lain untuk menghasilkan kondisi diabetes pada hewan coba, eksperimen nutrisi, dan sintesa organik (Windholz 1983). Pada hewan yang diberi alloxan terjadi defisiensi insulin (Thurston et al. 1975). Alloxan dan hasil dari reduksinya, asam dialurat, menghasilkan suatu siklus redoks dengan pembentukkan radikal superoksida. Radikal superoksida mengalami dismutase menjadi hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) (Szkudelski 2001). Alloxan menghasilkan efek diabetogeniknya dengan produksi hidrogen peroksida (Drews et al. 2000). Dengan adanya Fe 2+ dan hidrogen peroksida terbentuklah radikal hidroksil bereaktivitas tinggi oleh reaksi Fenton. Hal ini menimbulkan gangguan dalam sistem homeostasis kalsium intraseluler, yaitu terjadi peningkatan konsentrasi kalsium intraseluler yang menyebabkan kerusakan pada sel β pulau Langerhans (Szkudelski 2001). Dunn et al. (1943) dalam Szkudelski (2001) melaporkan mekanisme alloxan secara singkat dalam merusak sel β pankreas, antara lain dengan oksidasi komponen sel bergugus SH-, menghambat aktivitas glukokinase, pembentukkan radikal bebas, dan merusak sistem homeostasis intraseluler kalsium. Pemberian alloxan menyebabkan terjadinya degenerasi dari sel β pulau Langerhans pankreas sehingga menyebabkan terjadinya penurunan produksi insulin yang mengakibatkan kondisi diabetes mellitus tipe 1. Diabetes Mellitus Diabetes mellitus adalah suatu kelainan metabolisme ditandai dengan hiperglikemia, defisiensi sekresi insulin, resistensi insulin, atau bahkan keduanya (Gardner dan Shoback 2007). Hiperglikemia terjadi karena penyerapan glukosa ke dalam sel terhambat serta metabolismenya diganggu. Dalam keadaan normal, kira-kira 50% glukosa yang dimakan mengalami metabolisme sempurna menjadi CO 2 dan air, 5% diubah menjadi glikogen dan lemak. Pada diabetes mellitus seluruh proses tersebut terganggu, glukosa tidak dapat masuk ke dalam sel

16 sehingga energi terutama diperoleh dari metabolisme protein dan lemak (Ganiswarna 1995). Penderita diabetes mellitus biasanya mengalami gejala antara lain sering haus, poliuria, pandangan yang memudar serta penurunan berat badan (WHO 1999). Pada waktu kadar glukosa dalam ginjal berlebih, glukosa akan keluar melalui urin yang disebut glukosuria. Pada hewan yang menderita diabetes terjadi penurunan pertahanan tubuh terhadap infeksi bakterial dan fungal serta seringkali menjadi kronis sehingga mengarah kepada cystitis, prostatitis, bronchopneumonia dan dermatitis (Kahn 2005). Komplikasi yang mungkin timbul akibat diabetes mellitus yang berkepanjangan antara lain komplikasi retinopathy yang dapat menyebabkan kebutaan dan nephropathy yang dapat berlanjut menjadi gagal ginjal (WHO 1999). Penyakit lain yang dapat timbul juga adalah penyakit jantung, tekanan darah tinggi, stroke, katarak, kerusakan saraf, dan kehilangan pendengaran (Rindengan dan Novarianto 2005). Penyakit diabetes mellitus dibagi menjadi dua jenis utama, yaitu: a. Diabetes mellitus tipe 1 (DM Tipe 1) Diabetes mellitus tipe 1 diperkirakan sebagai T-lymphocyte-dependent autoimmune disease yang dicirikan dengan perusakkan sel-sel beta pulau Langerhans. Tipe ini disebut juvenile diabetes karena kebanyakan penderitanya adalah anak-anak dan remaja, tetapi kelainan metabolik ini dapat juga diderita seseorang dalam segala usia. Nama lain untuk tipe diabetes ini adalah Insulin Dependent Diabetes Mellitus (IDDM). Terjadinya kerusakan dari sel β Pulau Langerhans pankreas, seringkali secara autoimun, menghasilkan terhentinya produksi insulin. Penderita IDDM bergantung pada insulin untuk hidup, yaitu untuk menjaga kestabilan kadar glukosa darah (Chausmer 1998). b. Diabetes mellitus Tipe 2 (DM Tipe 2) Diabetes mellitus tipe 2 atau dikenal dengan Non Insulin Dependent Diabetes Mellitus (NIDDM) biasanya diderita orang dewasa di atas 40 tahun yang menderita obesitas (Gardner and Shoback 2007). Pada NIDDM, pankreas mampu menghasilkan insulin, kelainan terjadi karena terjadinya keterlambatan respon sekresi insulin terhadap kelebihan glukosa (Ganong 2002).

17 Superoksida Dismutase (SOD) Famili dari enzim-enzim yang dikenal dengan superoksida dismutase ditemukan dalam organisme pengguna oksigen dan sangat penting dalam pertahanan dari sel melawan radikal bebas oksigen (Chang et al. 1988). Sebagai suatu enzim, SOD memiliki fungsi sebagai antioksidan, yaitu dapat melindungi dari kerusakan sel dengan menetralisasi superoksida, salah satu senyawa radikal bebas yang bersifat merusak di alam. SOD mengkatalisa dismutasi anion superoksida radikal (O 2 ) menjadi hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) dan katalase memecah H 2 O 2 menjadi air (Devasagayam et al. 2004). SOD adalah suatu metaloenzim, dalam arti, selain asam amino, juga mengandung ion logam. Ada beberapa jenis SOD, antara lain Mn-SOD yang mengandung ion Mangan dan ditemukan di mitokondria, ekstraseluler SOD (EC- SOD), dan Cu,Zn-SOD yang terdapat di sitoplasma sel dan memegang peranan penting pada pertahanan tubuh (Cohen dan Nyska 2002). Cu,Zn-SOD memiliki 151 monomer asam amino dan berat 32 KDa. Kubisch et al. (1994) melaporkan bahwa Cu,Zn-SOD dapat melindungi sel β pankreas dari kerusakan akibat zat diabetogenik, antara lain alloxan. Hati memiliki kandungan Cu,Zn-SOD yang tinggi, karena itu pengamatan terhadap enzim ini pada hewan yang terpapar zat diabetogenik (alloxan) diharapkan dapat memberikan gambaran perubahan kandungan enzim tersebut pada kondisi sebelum dan sesudah diberi minyak kelapa murni (VCO). Virgin Coconut Oil (VCO) Virgin Coconut Oil atau minyak kelapa murni adalah minyak yang diperoleh dari daging buah kelapa tua yang segar yang proses produksinya tanpa atau dengan pemanasan. Saat ini, minyak kelapa murni umum digunakan untuk pengobatan penyakit. Manfaat kelapa murni untuk kesehatan di antaranya ialah mengurangi risiko atherosklerosis, menurunkan risiko kanker, membantu mencegah infeksi virus, mendukung sistem kekebalan tubuh, membantu mencegah osteoporosis, dan mengontrol diabetes mellitus (Rindengan dan Novarianto 2005).

18 Minyak kelapa murni mengandung vitamin E dan polifenol (antioksidan) serta asam laurat (Subroto 2006). Asam laurat merupakan asam lemak jenuh dengan rantai sedang karena jumlah karbonnya 12 dan lebih dikenal dengan nama medium chain fatty acid (MCFA). Dalam tubuh, asam laurat diubah menjadi monolaurin yang bermanfaat sebagai antivirus, antibakteri, dan antiprotozoa (Rindengan dan Novarianto 2005). Selain itu, asam laurat memiliki efek yang sangat potensial dalam menstimulir sekresi insulin oleh sel beta pulau Langerhans (Garfinkel et al. 1992). Dengan demikian, penderita diabetes mellitus dianjurkan untuk mengkonsumsi minyak kelapa murni karena bermanfaat dalam menstabilkan glukosa darah (Rindengan and Novarianto 2005). METODE PENELITIAN

19 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2007 sampai dengan bulan Juli 2008 di Laboratorium Bersama Hewan Percobaan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian dan SEAFAST Center serta di Laboratorium Histologi Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.. Materi Penelitian Penelitian ini menggunakan 25 ekor tikus jantan galur Sprague dawley (Rattus norvegicus) dengan berat badan berkisar antara gram. Semua tikus diadaptasikan selama 1 minggu dengan diberi ransum standar sebelum dilakukan penelitian. Tikus-tikus tersebut kemudian dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan, yaitu kelompok kontrol negatif (K-), kelompok kontrol positif (K+), kelompok diabetes yang dicekok VCO A (VA), kelompok diabetes yang dicekok VCO B (VB), serta kelompok diabetes yang dicekok minyak goreng (MG). Metode Penelitian Pembuatan Tikus Diabetes Mellitus Pertama-tama, tikus percobaan diadaptasikan selama 6 hari. Sehari sebelum diinjeksi alloxan tikus-tikus dipuasakan. Hari berikutnya, yaitu setelah dipuasakan tikus-tikus ditimbang berat badannya agar dapat menghitung dosis alloxan yang tepat. Dosis alloxan yang digunakan adalah 110 mg/kg berat badan tikus. Tikus diinjeksi alloxan secara intraperitoneal. Setelah dua hari, tikus diukur glukosa darahnya menggunakan glukometer. Tikus dengan kadar glukosa darah di atas 200 mg/dl dinyatakan menderita diabetes. Persiapan Hewan Coba Penelitian ini menggunakan tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague dawley sebanyak 25 ekor tikus yang dibagi dalam lima kelompok, yaitu: a. Kelompok kontrol negatif (K-) adalah tikus yang tidak diinduksi alloxan; b. Kelompok kontrol positif (K+) adalah tikus diabetes mellitus dan dicekok aquadest;

20 c. Kelompok VCO A adalah tikus diabetes mellitus yang dicekok dengan VCO A, yaitu VCO yang pembuatannya tanpa panas; d. Kelompok VCO B adalah tikus diabetes mellitus yang dicekok dengan VCO B, yaitu VCO yang pembuatannya dengan panas terkendali; e. Kelompok MG, adalah tikus diabetes mellitus yang dicekok dengan minyak goreng. Dosis aquadest, VCO, dan minyak goreng kelapa yang diberikan 5ml/ekor/hari. Seluruh tikus dalam setiap kelompoknya diberi perlakuan selama 28 hari. Di akhir perlakuan dilakukan pengambilan organ hati. Organ hati difiksasi dengan larutan Bouin selama 24 jam kemudian masuk dalam alkohol 70%. Setelah itu, dipotong-potong dan dimasukkan dalam tissue cassette untuk melewati proses dehidrasi dalam seri alkohol bertingkat yaitu mulai dari alkohol 80% sampai alkohol absolut. Penjernihkan jaringan hati dilakukan dalam xylol lalu di-embedding dalam parafin. Blok jaringan dipotong menggunakan mikrotom (5 µm) dan potongan jaringan dilekatkan pada gelas objek. Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) (Kiernan, 1990) Pewarnaan Hematoxylin Eosin dilakukan untuk mengamati struktur umum jaringan. Tahapan yang dilakukan dalam pewarnaan ini dimulai dengan deparafinisasi, yaitu penghilangan parafin dengan memasukkan preparat ke dalam seri larutan xylol III, II, I. Tahap selanjutnya adalah rehidrasi, yaitu dengan memasukkan preparat ke dalam seri larutan alkohol absolut sampai alkohol 70%. Preparat direndam dalam air keran, kemudian dalam aquadest. Preparat diwarnai dengan pewarna hematoxylin dilanjutkan lagi dengan perendaman dalam aquadest. Setelah itu, preparat diwarnai menggunakan eosin alkohol diikuti perendaman kembali dalam aquadest. Kemudian dilakukan proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat serta penjernihan (clearing) dengan menggunakan xylol. Sediaan ditutup dengan cover glass (mounting).

21 Pewarnaan Immunohistokimia Pewarnaan immunohistokimia dilakukan untuk mengamati kandungan enzim Cu,Zn-SOD pada jaringan hati. Langkah awal pewarnaan ini adalah deparafinisasi, rehidrasi, dan preparat direndam dalam distiled water (DW). Langkah selanjutnya adalah preparat dicelupkan dalam larutan 30 ml methanol yang dicampur dengan 0,3 ml H 2 O 2 dalam gelap. Kemudian, preparat direndam kembali dalam DW dan selanjutnya dicuci dengan phosphate buffer saline (PBS). Preparat kemudian diinkubasi dalam normal serum selama 1 jam pada suhu 37 C. Setelah itu, preparat dicuci kembali menggunakan PBS. Lalu preparat diinkubasikan antibodi monoklonal Cu,Zn-SOD (Sigma S2147) pada suhu 4 C selama dua malam. Preparat dicuci sebanyak tiga kali menggunakan PBS dan diinkubasi dalam antibodi sekunder, yaitu Dako Envision Peroxidase System pada suhu 37 C. Selanjutnya, dicuci dengan PBS, visualisasi dilakukan dengan diaminobenzidin (DAB) dalam tris buffer dan H 2 O 2. Untuk perbandingan dengan reaksi negatif, dilakukan counterstain dengan hematoxylin. Langkah akhir pewarnaan ini adalah dehidrasi, clearing, dan mounting. Parameter Hasil pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) pada potongan jaringan hati tikus semua kelompok diamati terhadap morfologi umum sel dan jaringan termasuk kerusakan sel dan jaringan. Pengamatan terhadap potongan jaringan hati yang diwarnai dengan teknik imunohistokimia dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Pengamatan secara kualitatif dilakukan dengan cara melihat intensitas warna jaringan hati yang terwarnai, sedangkan secara kuantitatif dengan menghitung jumlah inti sel hati pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD dan menghitung persentase jumlah inti sel hati yang bereaksi positif dan negatif terhadap Cu,Zn-SOD. Analisis Data Hasil pengamatan terhadap jumlah sel inti sel hati pada berbagai tingkat kandungan Cu, Zn-SOD disusun sebagai Rancangan Acak Lengkap (RAL) dan dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan.

22 HASIL Morfologi Hati Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) dilakukan untuk mewarnai morfologi sel atau jaringan hati. Hematoxylin bersifat basa akan mewarnai unsur jaringan yang bersifat asam (basofilik), yaitu inti sel. Sedangkan eosin bersifat asam sehingga berfungsi mewarnai sitoplasma yang bersifat basa (asidofilik). Jaringan hati pada kelompok kontrol positif dan kelompok minyak goreng menunjukkan terjadinya kerusakan-kerusakan sel seperti degenerasi dan nekrosa. Terdapat beberapa sel dengan inti dan sitoplasma yang membesar dan berwarna lebih pucat. Nekrosa sel hati ditandai dengan inti sel yang pecah. Pada kelompok perlakuan VCO A dan VCO B ditemukan degenerasi dan nekrosa namun tidak sebanyak yang tampak pada kelompok kontrol positif maupun kelompok perlakuan minyak goreng. Pada kelompok kontrol negatif ditemukan degenerasi dan nekrosa pada beberapa bagian sel tetapi masih dalam batas yang normal karena di dalam jaringan yang normal pasti terdapat beberapa sel yang mengalami degenerasi dan nekrosa (Gambar 1). Profil Cu, Zn-SOD Pewarnaan imunohistokimia dilakukan dengan tujuan untuk mendeteksi kandungan atau komponen aktif yang ada dalam jaringan atau sel yang melibatkan penggunaan antibodi. Prinsip dasar pewarnaan ini adalah adanya ikatan antara antigen dan antibodi. Pewarnaan imunohistokimia pada penelitian ini dilakukan untuk melihat adanya kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus kelompok kontrol, kelompok diabetes, dan kelompok perlakuan (VA, VB, dan MG). Pengamatan secara kualitatif dilakukan pada jaringan hati dengan cara mengamati intensitas warna yang terjadi. Semakin tua warna coklat pada jaringan hati, semakin tinggi kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tersebut. Pada kelompok diabetes (K+) dan kelompok minyak goreng (MG) kandungan Cu,Zn- SOD pada jaringan hati lebih rendah dibandingkan dengan kontrol negatif (K-). Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD kelompok VA lebih tinggi dibanding

23 kelompok K+, namun kandungan Cu,Zn-SOD kelompok VA masih lebih rendah dibanding kelompok K-. Pada kelompok VB, kandungan Cu,Zn-SOD lebih tinggi dibanding kelompok K+, namun kandungan Cu,Zn-SOD pada kelompok VB lebih rendah dibanding kelompok VA (Gambar 2). Pengamatan kuantitatif kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati dilakukan dengan menghitung jumlah inti sel hati yang bereaksi pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD. Reaksi tersebut dapat terlihat dengan adanya perbedaan intensitas warna pada inti sel hati, antara lain warna untuk reaksi positif, yaitu positif kuat yang ditunjukkan dengan warna coklat tua (+++), positif sedang yang ditunjukkan dengan warna coklat muda (++), positif lemah yang ditunjukkan dengan warna coklat sangat muda (+) dan untuk reaksi negatif ditunjukkan dengan warna biru (-). Hasil penghitungan jumlah inti sel hati pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Rata-rata jumlah inti sel hati yang bereaksi pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus perlakuan perlapang pandang pada pembesaran 40x Jumlah Inti Sel Hati Kelompok K- 71.7± 5.5 e 47.5 ± 5.9 d 26.1 ± 4.7 a 27.9 ± 5.6 b K ±14.1 b 35.2 ± 12.3 b 55.9 ± 8.6 d 57.1 ± 10.0 c VA 48.6 ± 6.6 d 44.3 ± 7.9 cd 29.3 ± 4.0 a 20.5 ± 5.2 a VB 38.1 ± 4.0 c 41.1 ± 4.7 c 35.3 ± 2.8 b 28.3 ± 3.6 b MG 21.5 ± 2.6 a 29.3 ± 3.4 a 44.5 ± 3.2 c 57.9 ± 15.2 c Keterangan : Superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan nilai yang berbeda nyata (p<0.05)

24 Gambar 1. Fotomikrograf jaringan hati tikus perlakuan K-: kontrol negatif, K+: kontrol positif, VA: diabetes + VCO A, VB: diabetes + VCO B, MG: diabetes + minyak goreng. Pewarnaan Hematoxylin Eosin skala 5µm.

25 Gambar 2. Fotomikrograf jaringan hati tikus perlakuan K-: kontrol negatif, K+: kontrol positif, VA: diabetes + VCO A, VB: diabetes + VCO B, MG: diabetes + minyak goreng. Pewarnaan imunohistokimia Cu,Zn-SOD skala 5µm.

26 Hasil uji statistik terhadap jumlah inti sel hati terhadap berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD menunjukkan kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati pada kelompok K+ lebih rendah dibanding kelompok K-. Hal ini terlihat pada jumlah inti sel yang bereaksi positif kuat dan positif sedang lebih rendah secara nyata (p<0.05) pada kelompok diabetes (K+) dibanding kelompok kontrol negatif. Rendahnya kandungan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari jumlah inti sel hati yang bereaksi negatif lebih tinggi secara nyata (p<0.05) pada kelompok diabetes (K+) dibanding kelompok kontrol negatif (K-). Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok VA dan VB lebih tinggi dibanding kelompok K+. Pada kelompok VA, jumlah inti sel yang memberikan reaksi positif kuat dan positif sedang lebih tinggi secara nyata (p<0.05) dibanding kelompok K+. Hal ini juga terlihat dari jumlah inti sel yang bereaksi negatif lebih rendah secara nyata (p<0.05) pada kelompok VA dibanding kelompok K+. Begitu juga pada kelompok VB, kandungan Cu,Zn-SOD kelompok VB lebih tinggi dibanding kelompok K+. Hal ini terlihat dari jumlah inti sel yang bereaksi positif kuat dan positif sedang lebih tinggi secara nyata (p<0.05) pada kelompok VB. Tingginya kandungan Cu,Zn-SOD pada kelompok VB juga dilihat dari jumlah inti sel yang bereaksi negatif lebih rendah secara nyata (p<0.05) dibanding kelompok K+. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok MG lebih rendah dibanding kelompok K-. Jumlah inti sel yang memberikan reaksi positif kuat dan positif sedang pada MG lebih rendah secara nyata (p<0.05) dibanding kelompok K-. Rendahnya kandungan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari jumlah inti sel bereaksi negatif pada MG lebih tinggi secara nyata (p<0.05) dibandingkan kelompok K-. Untuk melihat profil kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada hati tikus dilakukan dengan perhitungan persentase jumlah inti sel hati yang bereaksi positif dan negatif terhadap Cu,Zn-SOD (Gambar 3).

27 % JUMLAH K K+ VA VB MG KELOMPOK + Gambar 3. Persentase jumlah inti sel hati yang bereaksi positif dan negatif terhadap Cu,Zn-SOD. + : Positif; - : Negatif. Hasil persentase jumlah inti sel hati yang bereaksi positif dan negatif terhadap Cu,Zn-SOD menunjukkan kandungan Cu,Zn-SOD lebih rendah pada kelompok K+ dan MG dibandingkan dengan kelompok K-. Hal ini terlihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi positif lebih rendah pada kelompok K+ (67,9%) dan MG (62,1%) dibanding kelompok K- (83,9%). Rendahnya kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi negatif lebih tinggi pada kelompok K+ (32%) dan MG (37,8%) dibanding kelompok K- (16%). Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok VA lebih tinggi dibanding kelompok K+. Hal ini terlihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi positif lebih tinggi pada kelompok VA (85,6%) dibanding kelompok K+ (67,9%). Tingginya kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi negatif lebih rendah pada kelompok VA (14,4%) dibanding kelompok K+ (32%). Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD kelompok VB lebih tinggi dibanding kelompok K+. Hal ini dapat dilihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi positif lebih tinggi pada kelompok VB (80,2%) dibanding kelompok K+ (67,9%). Tingginya kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi negatif lebih rendah pada kelompok VB (19,8%) dibanding kelompok K+ (32%). Jika kelompok VA dan kelompok VB dibandingkan, kandungan antioksidan Cu,Zn- SOD kelompok VA lebih tinggi dibanding kelompok VB. Hal ini terlihat dari persentase jumlah inti sel hati pada reaksi positif lebih tinggi pada kelompok VA

28 (85,6%) dibanding kelompok VB (80,2%). Tingginya kandungan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi negatif lebih rendah pada kelompok VA (14,4%) dibanding kelompok VB (19,8%).

29 PEMBAHASAN Morfologi Hati Hati merupakan organ yang sangat penting untuk proses fisiologi normal sistem dalam tubuh. Hampir seluruh proses metabolisme terjadi di hati. Hati berperan penting dalam mengatur metabolisme lemak, protein, karbohidrat dan juga mempertahankan kadar glukosa darah normal (Rodney dan Tanner 2004). Apabila terjadi gangguan pada proses metabolisme tersebut maka akan menyebabkan gangguan pada fungsi hati. Jaringan hati kelompok diabetes mellitus (K+) yang diinduksi alloxan dan hanya dicekok aquadest dengan pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) terlihat mengalami beberapa perubahan patologis. Perubahan patologis yang terjadi berupa degenerasi dan nekrosa sel-sel hati. Kondisi diabetes mellitus menyebabkan tubuh tidak dapat menggunakan glukosa sebagai sumber energi akibat defisiensi insulin sehingga tubuh mencari sumber energi lain, antara lain dengan pemecahan glikogen, protein, dan lipid. Proses pemecahan glikogen, protein dan lipid, selain menghasilkan energi juga menghasilkan produk sampingan, yaitu radikal bebas. Bila proses ini berlangsung secara terus-menerus, jumlah radikal bebas yang terbentuk semakin banyak. Jumlah radikal bebas yang tinggi dalam tubuh menyerang biomakromolekul yang merupakan komponen dinding sel. Akibatnya, fungsi dinding sel menurun sehingga menimbulkan kerusakan sel berupa degenerasi dan nekrosa seperti terlihat pada kelompok K+ pada penelitian ini (Halliwell dan Gutteridge 1999). Jaringan hati kelompok K- mengalami degenerasi sampai dengan nekrosa terendah. Hal ini disebabkan kelompok K- tidak diinduksi alloxan sehingga tidak timbul kondisi diabetes mellitus. Jaringan hati kelompok MG yang diinduksi alloxan dan dicekok minyak goreng terlihat mengalami perubahan patologis berupa degenerasi sampai dengan nekrosa yang menyebar pada sel-sel hati. Pada kondisi diabetes mellitus, tubuh harus mencari sumber energi lain, antara lain dengan peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid menghasilkan produk sampingan berupa radikal bebas. Proses ini berlangsung secara terus-menerus sehingga jumlah radikal bebas dalam tubuh

30 bertambah banyak dan berakibat pada kerusakan sel. Jumlah radikal bebas yang tinggi pada kondisi diabetes mellitus akan bertambah dengan perlakuan cekok minyak goreng. Minyak goreng mengandung asam lemak tak jenuh tinggi yang memicu peroksidasi lipid dan hasil sampingannya berupa radikal bebas bertambah banyak. Jumlah radikal bebas yang tinggi menyebabkan penyerangan terhadap biomakromolekul, yang merupakan komponen dinding sel, lebih tinggi sehingga menimbulkan kerusakan sel berupa degenerasi dan nekrosa yang lebih parah. Pemberian minyak kelapa murni (VCO) pada perlakuan VA dan VB menunjukkan bahwa kerusakan sel berupa degenerasi dan nekrosa yang terjadi lebih rendah dibandingkan dengan kelompok diabetes (K+) dan kelompok perlakuan minyak goreng (MG). Hal ini disebabkan VCO mengandung asam laurat yang cukup tinggi, mencapai 53% (Rindengan dan Novarianto 2005). Asam laurat atau lebih dikenal dengan nama medium chain fatty acid (MCFA) mudah diserap ke dalam mitokondria sel sehingga metabolisme meningkat. Dengan adanya peningkatan metabolisme maka sel-sel bekerja lebih efisien untuk membentuk sel-sel baru serta mengganti sel-sel yang rusak lebih cepat. VCO juga mengandung vitamin E dan polifenol yang merupakan antioksidan kuat. Polifenol dan vitamin E berperan sebagai antioksidan yang membantu antioksidan endogen dalam menetralisir radikal bebas. Radikal bebas yang lebih sedikit mengurangi penyerangan terhadap biomakromolekul sehingga kerusakan pada dinding sel yang dapat menyebabkan penurunan fungsi sel tidak terjadi dan kerusakan sel berupa degenerasi dan nekrosa dapat dicegah. Hal inilah yang menyebabkan kelompok VA dan VB menunjukkan kerusakan sel berupa degenerasi dan nekrosa lebih sedikit dibandingkan kelompok K+ dan MG. Profil Cu,Zn-SOD Pada kondisi diabetes mellitus terjadi gangguan pada metabolisme, terutama metabolisme karbohidrat. Hal ini disebabkan oleh defisiensi sekresi insulin, resistensi insulin, atau bahkan keduanya di dalam tubuh sehingga kadar glukosa dalam darah meningkat dan menimbulkan hiperglikemia. Pada kondisi diabetes, tubuh tidak dapat menggunakan glukosa sebagai sumber energi sehingga tubuh mencari sumber energi lain, yaitu lemak. Tubuh akan melakukan proses

31 lipolisis di dalam hati, yaitu pemecahan lemak sebagai sumber energi. Proses pemecahan lemak, selain menghasilkan energi juga menghasilkan produk sampingan, yaitu radikal bebas. Bertambahnya jumlah radikal bebas akibat proses pemecahan lemak secara terus-menerus untuk menghasilkan energi pada kondisi diabetes mellitus akan menyebabkan antioksidan tubuh tidak dapat mengatasi kelebihan radikal bebas tersebut sehingga menimbulkan stres oksidatif di mana jumlah oksidan melebihi jumlah antioksidan. Pada kelompok diabetes (K+) dan perlakuan minyak goreng (MG) terlihat kandungan Cu,Zn-SOD lebih rendah dibanding kelompok K-. Hal ini terjadi karena pada kondisi diabetes, jumlah radikal bebas dalam tubuh tinggi sehingga antioksidan tidak mampu mengatasi kelebihan radikal bebas tersebut dan menghasilkan stres oksidatif. Keadaan stres oksidatif menyebabkan kandungan antioksidan, seperti Cu,Zn-SOD, lebih rendah. Wresdiyati et al. (2003) telah melaporkan bahwa pada kondisi diabetes kandungan antioksidan-superoksida dismutase (SOD) dalam jaringan hati Macaca fascicularis lebih rendah akibat jumlah radikal bebas yang tinggi dalam tubuh. Sedangkan pada kelompok MG, minyak goreng mengandung asam lemak tak jenuh tinggi yang dapat meningkatkan peroksidasi lipid sehingga jumlah radikal bebas yang dihasilkan lebih tinggi. Jumlah radikal bebas yang tinggi dalam tubuh menyebabkan antioksidan tubuh tidak mencukupi untuk melawan radikal bebas sehingga kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok MG lebih rendah dibanding kelompok K-. Pemberian VCO pada jaringan hati tikus yang mengalami diabetes dapat memberikan pengaruh nyata terhadap penambahan kandungan antioksidan dalam tubuh. Hal ini disebabkan VCO mengandung asam laurat yang tinggi. Menurut laporan Garfinkel et al. (1992), asam laurat memiliki efek yang sangat potensial dalam menstimulir sekresi insulin oleh sel beta pulau Langerhans pankreas. Dengan dihasilkannya insulin, pembentukkan radikal bebas yang lebih banyak dapat dicegah sehingga jumlah antioksidan untuk menetralisir radikal bebas lebih sedikit dan sisa antioksidan yang dipertahankan lebih banyak. VCO juga memiliki kandungan antioksidan berupa vitamin E dan polifenol (Subroto 2006). Vitamin E dan polifenol membantu kerja Cu,Zn-SOD sebagai antioksidan

32 endogen dalam menahan serangan dari radikal bebas. Akibatnya semakin sedikit antioksidan Cu,Zn-SOD yang melakukan perlawanan terhadap radikal bebas sehingga sisa antioksidan Cu,Zn-SOD yang dipertahankan lebih banyak. Hal tersebut yang menyebabkan kandungan antioksidan endogen pada kelompok perlakuan diabetes yang diberi VCO lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok diabetes. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok VA lebih tinggi dibandingkan kelompok VB. Hal ini disebabkan oleh perbedaan proses produksi minyak kelapa murni kedua kelompok tersebut. VA atau minyak kelapa murni A diproduksi tanpa panas, sedangkan VB atau minyak kelapa murni B dengan panas terkendali. Menurut Subroto (2006), tinggi rendahnya kandungan vitamin E dan polifenol dalam VCO ditentukan oleh kualitas bahan bakunya dan proses produksi yang digunakan. Proses produksi yang menerapkan penggunaan panas dapat menurunkan kadar vitamin E dan polifenol sekitar 25%, bahkan dapat hilang sama sekali dengan pemanasan berlebihan. VA memiliki kandungan asam laurat, vitamin E dan polifenol yang lebih tinggi dibanding VB sehingga lebih efektif dalam membantu kerja antioksidan Cu,Zn-SOD untuk menetralisir radikal bebas. Jumlah radikal bebas pada VA lebih sedikit sehingga jumlah antioksidan Cu,Zn- SOD untuk menangkap radikal bebas pun lebih sedikit dan sisa Cu,Zn-SOD yang dipertahankan pada kelompok VA lebih banyak dibanding pada kelompok VB.

33 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan 1. Minyak kelapa murni (VCO) mampu meningkatkan kandungan antioksidan copper,zinc superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) dan menurunkan jumlah kerusakan sel pada jaringan hati tikus dalam kondisi diabetes mellitus. 2. Pengaruh pemberian minyak kelapa murni (VCO) terhadap peningkatan antioksidan copper,zinc superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) lebih efektif pada kelompok yang diberi VCO yang diproduksi tanpa panas. Saran Disarankan kepada masyarakat, khususnya penderita diabetes mellitus, untuk mengatur pola makan dan mengkonsumsi antioksidan eksogen, seperti VCO, secara teratur.

34 DAFTAR PUSTAKA Chang, L, LW. Slot, HJ. Geuze, JD. Crapo Molecular immunocytochemistry of the cu,zn-superoxide dismutase in rat hepatocytes. J. Cell Biol. 107(6): Chausmer, AB Zinc, insulin, and diabetes. J. Am. Coll. Nut. 17(2): Cohen, K, A. Nyska Oxidation of biological system: oxidative stress phenomena, antioxidants, redox reaction, and methods for their quantifications. Toxicologic Path. 30(6): Dellman, HD, J. Eurell Textbook of Veterinary Histology 5 th ed. Baltimore, Maryland USA: Lippincott Williams and Wilkins. Pp Devasagayam, TPA, JC. Tilak, KK. Boloor, KS. Sane, SS. Ghaskadbi, RD. Lele Free radicals and antioxidants in human health: Current status and future prospects. JAPI. 52(10): Drews, G, C. Krämer, M. Düfer, P. Krippeit-Drews Contrasting effects of alloxan on islets and single mouse pancreatic β Cells. Biochem J. 352: Ganiswarna, SG Farmakologi dan Terapi Ed. 4. Jakarta: Bagian Farmakologi FKUI. Pp. 471 Ganong, WF Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran AGC. Penerjemah: Brahm U Pendit. Terjemahan dari: Review of Medical Physiology. Pp ; Gardner, DG, D. Shoback Greenspan s Basic and Clinical Endocrinology. USA: The McGraw-Hill Companies. Pp Garfinkel, M, S. Lee, SC Opera, OE Akwari Insulinotropic potency of lauric acid, a metabolic rationale for Medium Fatty Acid (MCF) in TPN formulation. J. Surg 52(4) : Gitawati, R Radikal bebas, sifat dan peranan dalam menimbulkan kerusakan atau kematian sel. Cermin Dunia Kedokteran 102:33-36 Guyton, AC, JE. Hall Textbook of Medical Physiology. Penerjemah Irawati Setiawan dkk. Jakarta: EGC Penerbit Buku Kedokteran. Pp

35 Halliwell BJ, MC. Gutteridge Free Radical in Biology and Medicine. 3 rd Ed. Oxford: University Press. Pp ; Kahn, C The Merck Veterinary Manual 9 th ed. Philadelphia: Merck & Co. Inc. Pp Kiernan, JA Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. 2 nd Ed. Oxford: Pergamont Press. Pp Kubisch, HM, J. Wang, R. Luche, E. Carlson, TM. Bray, CJ. Epstein, JP. Phillips Transgenic copper,zinc superoxide dismutase modulates susceptibility to type I diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: O Malley, B Clinical Anatomy and Physiology of Exotic Species. London: Elseviers Saunders. Pp. 217 Rindengan, B, H. Novarianto Pembuatan dan Pemanfaatan Minyak Kelapa Murni. Jakarta: Penebar Swadaya. Pp Rodney, A, GA. Tanner Medical Physiology. USA: Lippincott Williams and Wilkins. Pp Subroto, A Antibakteri dan Antioksidan di Minyak Perawan. Trubus. Pp [April 2006] Szkudelski, T The mechanism of alloxan and streptozotocin in β cells of the rat pancreas. Physiol. Res. 50: Thurston, JH, RE. Hauhart, EM. Jones, JL. Ater Effects of alloxan diabetes, anti-insulin serum diabetes, and non-diabetic dehydration on brain carbohydrate and energy metabolism in young mice. J. Biol. Chem. 250(8): WHO Definition, Diagnosis, and Classification of Diabetes Mellitus and It s Compilcation. Geneva: WHO. Pp Windholz, M The Merck Index 10 th ed. USA: Merck and Co. Inc. Pp Wresdiyati T, RPA. Lelana, IKM. Adyane, K. Noor Immunohistichemical study of superoxide dismutase in the liver of alloxan diabetes mellitus macaques. Hayati : 61-65A

36 LAMPIRAN

37 Lampiran 1. Proses Preparasi Jaringan Hati Difiksasi dalam Bouin (24 jam) Stopping point alkohol 70% Dehidrasi dalam alkohol bertingkat Clearing dengan xylol Embedding dalam paraffin Pemotongan dengan mikrotom

38 Lampiran 2. Proses Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) Sediaan Deparafinisasi rehidrasi (xylol III-I, alkohol absolut III-I dan alkohol 5 menit Air mengalir (10-15 menit) Aquadest (5-10 menit) Hematoxylin (12 detik) Air mengalir (5 menit) Aquadest (5 menit) Eosin (3 menit) Aquadest (5 menit) Dehidrasi dan Clearing (alkohol 70%- 95%, absolut I-III, xylol I-III) 3-5 menit Mounting

39 Lampiran 3. Proses Pewarnaan Imunohistokimia Deparafinisasi Rehidrasi DW (10-15 menit) Hidrogen Peroksida dalam Metanol DW 2x (5-10 menit) PBS 2x (5-10 menit) Serum Normal 10% 60 µm/sediaan 60 menit, 37 C PBS 3x (5 menit) Antibodi SOD (1:200) µm/sediaan 2 malam, 4 C PBS 3x (10 menit) DAKO Envision Peroxidase System µm/sediaan 60 menit, 37 C dalam gelap PBS 3x (5 menit) DAB + H 2 O 2 (25 menit) cek mikroskop Counterstain dengan Hematoxylin

40 Dehidrasi, Clearing, Mounting Lampiran 4. Analisis Sidik Ragam dengan uji lanjutan Duncan terhadap Jumlah Inti Sel Hati Jumlah Inti Sel Hati Kelompok K ± 5.5 e 47.5 ± 5.9 d 26.1 ± 4.7 a 27.9± 5.6 b K ±14.1 b 35.2 ± 12.3 b 55.9 ± 8.6 d 57.1 ± 10.0 c VA 48.6 ± 6.6 d 44.3 ± 7.9 cd 29.3 ± 4.0 a 20.5 ± 5.2 a VB 38.1 ± 4.0 c 41.1 ± 4.7 c 35.3 ± 2.8 b 28.3 ± 3.6 b MG 21.5 ± 2.6 a 29.3 ± 3.4 a 44.5 ± 3.2 c 57.9 ± 15.2 c Sumber Keragaman JK db KT F hitung Sig. PositifKuat Perlakuan Galat Total PositifSedang Perlakuan Galat Total PositifLemah Perlakuan Galat Total Negatif Perlakuan Galat Total PositifKuat Subset untuk alfa 0.05 Perlakuan N a b c d e MG K VB VA K Sig

41 PositifSedang Perlaku Subset untuk alfa 0.05 an N a b c d MG K VB VA K Sig PositifLemah Perlaku Subset untuk alfa 0.05 an N a b c d K VA VB MG K Sig Negatif Perlaku Subset untuk alfa 0.05 an N a b c VA K VB K MG Sig Keterangan: K- : Kontrol negatif K+ : Kontrol positif VA : VCO A (VCO yang diproduksi dengan pemanasan) VB : VCO B (VCO yang diproduksi tanpa panas) MG : Minyak goreng +++ : Positif kuat ++ : Positif sedang + : Positif lemah

42 - : Negatif