ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA Bradyrhizobium japonicum DINI NURDIANI

Transkripsi

1 ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA Bradyrhizobium japonicum DINI NURDIANI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006

2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Analisis Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal dari atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Januari 2006 Dini Nurdiani NIM G

3 ABSTRAK DINI NURDIANI. Analisis Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum melalui Mutagenesis dengan Transposon. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan ARIS TRI WAHYUDI. Bradyrhizobium japonicum merupakan salah satu spesies bakteri dari kelompok Rhizobia yang umumnya dapat membentuk bintil akar pada tanaman Kedelai (Glycine max). Asosiasi antara bakteri bintil akar (BBA) dengan tanaman kelompok legum dapat menghasilkan fiksasi N 2 atmosfer menjadi NH 3 yang dapat digunakan untuk pertumbuhan tanaman. Keasaman tanah merupakan salah satu masalah yang secara signifikan mempengaruhi produksi pertanian di banyak tempat di seluruh dunia. Penurunan ph tanah mempengaruhi organisme tanah termasuk mikroflora. Salah satu sistem biologi yang dipengaruhi oleh penurunan ph tanah adalah simbiosis antara BBA dan tanaman kelompok legum. Hal ini dapat mempengaruhi hasil asosiasi antara keduanya dalam fiksasi N 2 menjadi NH 3. Beberapa galur B. japonicum telah dilaporkan memiliki toleransi yang tinggi terhadap asam-al, diantaranya yaitu BJ11, BJ38, dan KDR15. Adanya galur-galur toleran tersebut dapat menjadi sumber eksplorasi materi genetik yang berperan dalam toleransi B. japonicum pada media asam-al, yaitu dengan melakukan analisis gen penyandi ketahanan B. japonicum terhadap cekaman asam-al di lingkungannya. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan analisis fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi B. japonicum terhadap cekaman asam-aluminium. Mutagenesis dengan transposon dilakukan melalui konjugasi antara Escherichia coli S17-1 (λ pir) yang membawa putmini-tn5km1 dan B. japonicum toleran asam-al pada perbandingan 1:1. Frekuensi konjugasi berkisar antara sel/resipien dengan frekuensi konjugasi tertinggi dicapai oleh galur BJ11 sebesar 7.1x10-6 sel/resipien pada waktu inkubasi mating 24 jam. Mutagenesis ini menghasilkan tujuh mutan sensitif asam-al yang tidak mampu tumbuh pada media Ayanaba (ph 4.5 dan Al 50 µm). Salah satu mutan yaitu AAS11.2 digunakan sebagai model analisis molekuler gen yang terlibat dalam toleransi asam-al. AAS11.2 dapat membentuk bintil pada tanaman siratro yang menunjukkan gen yang terlibat dalam toleransi asam-al tidak berhubungan dengan nodulasi. Fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi asam-al dari mutan AAS11.2 telah berhasil diisolasi dengan inverse PCR menghasilkan amplikon yang berukuran 0.8 kb. Fragmen ini berhasil diklon ke dalam pgem-t Easy ( 3 kb) untuk memperoleh plasmid rekombinan yang didesain sebagai pgemt-11 ( 3.8 kb), dan disekuen. Hasil analisis sekuen menunjukkan sekuen fragmen DNA tersebut memiliki similaritas yang tinggi dengan gen yhfk yang menyandikan putative inner membrane protein dari Salmonella typhimurium (79% identity dan 84% similarity, E-value= 1.0xe -100 ) yang berfungsi sebagai efflux transporter.

4 ABSTRACT DINI NURDIANI. Analysis of Genomic DNA Fragment Involved in Acid- Aluminium Tolerance in Bradyrhizobium japonicum. Under the direction of ANJA MERYANDINI and ARIS TRI WAHYUDI. Bradyrhizobium japonicum is one of Rhizobia species which generally form root nodule on soybean plant (Glycine max). In association with leguminous plant, root nodule bacteria (RNB) fix atmospheric nitrogen (N 2 ) into NH 3 which can be used for plant growth. Soil acidity is a significant problem affecting agricultural production in many areas of the world. Lowering ph of the soil can affect soil organisms including the microflora. Among the biological system affected by the decrease in soil ph are those between RNB and leguminous plants. It could affect the association result between them in fixing nitrogen. In the previous work, screening indigenous B. japonicum strains which tolerant to acid-aluminium has been reported. The potential strains were strains BJ11, BJ38, and KDR15. These tolerant strains could become a source of genetic material exploration which involved in acid-al tolerance in B. japonicum. Transposon delivery was carried out through conjugation between Escherichia coli S17-1 (λ pir) carrying putmini-tn5km1 and acid-al tolerant B. japonicum at 1:1 ratio. Frequency of transconjugation was in the range of cells per recipients. A mutant AAS11.2 did not able to grow on the Ayanaba medium (ph 4.5) supplemented with 50 µm aluminium. AAS11.2 was able to form root nodule on siratro plant indicating that the gene involved in acid-al tolerance was not related with nodulation. A 0.8 kb of the genomic DNA fragment flanking transposon involved in acid-al tolerance was successfully isolated by inverse polymerase chain reaction (inverse PCR) from AAS11.2 genome. This fragment was subsequently cloned into pgem-t Easy ( 3 kb) to yield a recombinant plasmid, designated as pgemt-11 ( 3.8 kb), and sequenced. DNA sequenced analysis revealed that the genomic DNA fragment sequence had high homology with yhfk gene encoding putative inner membrane protein from Salmonella typhimurium (79% identity and 84% similarity, E-value= 1.0xe -100 ) which function as efflux transporter.

5 Hak cipta milik Dini Nurdiani, tahun 2006 Hak cipta dilindungi Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apa pun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya.

6 ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA Bradyrhizobium japonicum DINI NURDIANI Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Departemen Biologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

7 Judul Tesis Nama NIM 2006 : Analisis Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum : Dini Nurdiani : G Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Anja Meryandini, M.S. Ketua Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. Anggota Diketahui Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Dedy Duryadi S., DEA Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc. Tanggal Ujian: 1 Februari 2006 Tanggal Lulus:

8 PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul Analisis Fragmen DNA genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-Aluminium pada Bradyrhizobium japonicum. Penelitian ini dibiayai oleh Hibah Bersaing No. XIII tahun Pada kesempatan ini penulis juga ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Anja Meryandini, MS. dan Dr. Aris Tri Wahyudi, MSi. selaku pembimbing atas saran, kritik, dan bimbingannya serta bantuan biaya dan fasilitas bahan-bahan yang digunakan selama penelitian. Kepada Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, selaku kepala Laboratorium Research Center for Microbial Diversity (RCMD), penulis mengucapkan terima kasih atas fasilitas laboratorium yang diberikan terutama dalam telaah genetika molekuler dari galur-galur mutan B. japonicum. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada ibu Ani Fitriani atas saran, bantuan dan kerjasamanya terutama dalam menggunakan fasilitas di Laboratorium RCMD. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, kakak-kakak dan adik-adik, atas segala doa dan kasih sayangnya, serta kepada laboran dan temanteman di Laboratorium Mikrobiologi Rika, Elsie, Andini, Henry, Wulan, Risa, Prima dan juga kepada teman-teman yang namanya tidak dapat disebutkan satu persatu, atas bantuan dan kerjasamanya selama penelitian ini. Akhir kata, penulis berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Januari 2006 Dini Nurdiani

9 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 17 Juli 1974 di Kuningan, Jawa Barat sebagai anak kelima dari pasangan bapak Drs. H. Mahmud (alm.) dan ibu E. Muthiah. Tahun 1992 penulis lulus dari SMA Muhammadiyah Cirebon dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, lulus pada tahun Sejak tahun 2000 penulis bekerja sebagai staf pengajar di Universitas Kuningan. Pada tahun 2003, penulis diterima pada program studi Biologi sub program Mikrobiologi, Sekolah Pascasarjana IPB. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Direktorat Pendidikan Tinggi melalui program BPPS.

10 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL. DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN. vi vii viii PENDAHULUAN 1 TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Bintil Akar. 4 Toleransi Bakteri Bintil Akar terhadap Cekaman Lingkungan Asam... 5 Mutagenesis dengan Transposon pada Bakteri.. 7 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat. 11 Metode HASIL Penentuan Resistensi terhadap Antibiotik.. 22 Mutagenesis dengan Transposon dan Seleksi Mutan B. japonicum Sensitif Asam-Al 23 Uji Pembentukan Bintil Akar. 25 Isolasi DNA Genom Pengapit Transposon dengan Inverse PCR dan Kloning Produk Inverse PCR. 26 Analisis Sekuen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-Al 27 PEMBAHASAN SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN.. 41

11 DAFTAR TABEL Halaman 1 Pertumbuhan galur B. japonicum dan E.coli pada media agar yang mengandung antibiotik Frekuensi Konjugasi putmini-tn5km1 dari E. coli S17-1 (λ pir) ke B. japonicum pada tiga waktu inkubasi mating yang berbeda Hasil uji pembentukan bintil akar pada tanaman siratro (Macroptilium atropupureum) dan kedelai (Glycine max)

12 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 A) Peta plasmid putmini-tn5km1. B) transposon mini-tn5km1 9 2 Mutagenesis dengan transposon dari sel E. coli S17-1 (λ pir) (putmini-tn5km1) ke sel B. japonicum melalui proses konjugasi Strategi amplifikasi DNA genom pengapit transposon dengan inverse PCR 18 4 Penampilan pertumbuhan B. japonicum toleran asam-al galur BJ11, KDR15, dan BJ38 pada media YMA + CR % + rifampisin 50 µg/ml setelah inkubasi selama 8 hari pada suhu ruang A) Bintil akar tanaman siratro yang terbentuk hasil inokulasi dengan B. japonicum KDR15 (WT), dengan B) akar tanaman siratro yang terbentuk hasil inokulasi dengan mutan AAS A) Elektroforesis gel agarosa DNA genom pengapit transposon yang berhasil diamplifikasi dengan inverse PCR dari genom mutan B. japonicum sensitif asam-al AAS11.2 (1) dan M= marker DNA 1 kb ladder plus. B) Peta plasmid rekombinan pgemt-11 ( 3.8 kb) A) Hasil Elektroforesis gel agarosa plasmid rekombinan. M= Marker DNA 1 kb ladder plus, 1 dan 2= pgem-t11 yang dipotong dengan EcoRI. B) Hasil verifikasi DNA sisipan (insert) dalam plasmid rekombinan dengan PCR pada gel agarosa 1% Hasil pensejajaran (alignment) homologi antara sekuen fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi asam-al pada B. japonicum dengan S. typhimurium... 28

13 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tabel komposisi media agar Ayanaba (Ayanaba et al. 1983) Komposisi larutan hara Ahmed dan Evans yang telah dimodifikasi (Speidel & Wollum 1980) Komposisi larutan hara bebas N menurut Alva et al. (1988).. 44

14 PENDAHULUAN Latar Belakang Kedelai merupakan sumber protein penting dan menjadi komponen utama sejumlah makanan yang biasa dikonsumsi masyarakat Indonesia. Nilai penting kedelai semakin meningkat dengan adanya program diversifikasi pangan dari pemerintah untuk mencapai kecukupan dan ketahanan dalam produksi pangan. Meskipun hasil produksi per hektar dan luasan pertanaman kedelai meningkat secara tetap, namun total produksi kedelai tidak mampu memenuhi kebutuhan di dalam negeri. Untuk meningkatkan produksi kedelai melalui perluasan lahan pertanian terdapat sejumlah kendala, karena pada lahan yang baru dibuka pada umumnya memiliki karakteristik tanah asam seperti tingginya kandungan Al dan Mn serta rendahnya kadar fosfat dan Ca (Saleh & Sumarno 1995). Keasaman tanah merupakan suatu masalah yang secara signifikan mempengaruhi produksi pertanian di banyak tempat di seluruh dunia (Watkin et al. 1997). Penurunan ph tanah mempengaruhi organisme tanah termasuk mikroflora. Salah satu sistem biologi yang dipengaruhi oleh penurunan ph tanah adalah simbiosis antara bakteri bintil akar (BBA) dan tanaman kelompok legum. Asosiasi antara keduanya menghasilkan fiksasi N 2 atmosfer menjadi NH 3 yang dapat digunakan untuk pertumbuhan tanaman (Tiwari et al. 1992). Fiksasi nitrogen melalui simbiosis Rhizobium-legum memiliki nilai penting di bidang pertanian karena mekanisme ini mengarah pada meningkatnya nitrogen terikat di dalam tanah. Defisiensi nitrogen seringkali terjadi pada lahan yang kurang subur, tetapi legum yang mengalami nodulasi dapat tumbuh dengan baik pada lahan tersebut, sedangkan tanaman lain tidak dapat tumbuh (Madigan et al. 2003). Kegagalan simbiosis Rhizobium-legum dalam menambat N 2 pada tanah asam dikarenakan miskinnya ketahanan hidup dan pertumbuhan dari BBA, atau hambatan inisiasi dan pembentukan bintil akar. Faktor-faktor yang berhubungan dengan keasaman tanah yang berperanan penting dalam kegagalan tersebut adalah tingginya konsentrasi proton, rendahnya konsentrasi kalsium dan fosfat (Watkin et al. 1997), serta meningkatnya konsentrasi aluminium seiring dengan menurunnya ph tanah yang bersifat toksik terhadap BBA (Tiwari et al. 1992). Oleh karena itu

15 2 perluasan pemanfaatan lahan asam untuk tanaman kedelai membutuhkan introduksi galur BBA yang toleran terhadap kondisi asam tersebut. Bradyrhizobium japonicum merupakan salah satu spesies bakteri dari kelompok Rhizobia yang umumnya dapat membentuk bintil akar pada tanaman kedelai (Glycine max). ph optimum bagi pertumbuhan Bradyrhizobium berkisar antara 6-7 (Holt et al. 1994), akan tetapi isolat dari beberapa spesies Bradyrhizobium telah diidentifikasi memiliki kemampuan toleransi yang unggul terhadap cekaman pada tanah seperti ph rendah dan fosfat rendah (Bottomley 1992). Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan seleksi terhadap galur-galur B. japonicum indigenus toleran media asam-al dan diperoleh tiga galur toleran dengan nomor sandi galur BJ11 (Endarini et al. 1995), BJ38 (Fitri 1995), dan KDR15 (Imas et al. 1994). Kemampuan tumbuh dari galur toleran seperti BJ11 pada media kaldu Ayanaba (ph 4.5; Al 50 µm) menunjukkan bahwa galur tersebut mampu mengakumulasi ammonium yang menyebabkan peningkatan ph media. Wahyudi et al. (1998) juga melaporkan bahwa galur BJ11 merupakan galur yang kompetitif dan berpotensi untuk dikembangkan sebagai galur introduksi (inokulan) pada lahan asam dengan menggunakan varietas kedelai yang juga toleran asam. Adanya galur-galur toleran tersebut dapat menjadi sumber eksplorasi materi genetik yang berperan dalam toleransi B. japonicum pada media asam-al, yaitu dengan melakukan analisis gen penyandi ketahanan B. japonicum terhadap cekaman asam-al di lingkungannya. Semua gen yang berperan dalam nodulasi pada Bradyrhizobium sejauh ini diketahui berlokasi pada kromosom. Umumnya, galur Rhizobium memiliki plasmid simbiotik yang membawa gen-gen nod, nif, dan fix. Meskipun plasmid yang berukuran besar ditemukan pada beberapa Bradyrhizobium, namun tidak terdapat gen simbiotik yang berlokasi pada plasmid tersebut (Barbour et al. 1992). Bahkan berdasarkan data hasil penelitian yang dilakukan oleh Sari (1998) dilaporkan bahwa enam galur uji B. japonicum indigenus dengan sandi galur 09, 11, 15, 33, 43, dan 45 tidak mempunyai plasmid indigenus. Untuk mempelajari gen yang terlibat dalam toleransi B. japonicum terhadap cekaman asam-al dapat dilakukan isolasi dan karakterisasi dari mutan B. japonicum sensitif asam-al melalui mutagenesis dengan transposon.

16 3 Transposon adalah elemen DNA yang dapat berpindah dari satu tempat ke tempat lain dalam suatu genom (Madigan et al. 2003). Insersi transposon biasanya akan menimbulkan suatu gen menjadi inaktif. Salah satu kegunaan penting dari transposon yaitu untuk mutagenesis, karena gen yang telah disisipi oleh transposon akan mengalami mutasi yaitu gen tersebut tidak dapat terekspresi. Kegunaan lain dari transposon yaitu dapat memudahkan untuk memetakan secara fisik maupun genetik dari suatu gen yang telah disisipi transposon dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease (Snyder & Champness 1997). Transposon yang digunakan pada penelitian ini adalah transposon mini-tn5km1 yang membawa gen resistensi terhadap kanamisin yang telah dikonstruksi dalam plasmid put (didesain putmini-tn5km1). Penyisipan yang stabil pada kromosom dapat diperoleh ketika transposon mini-tn5 berpindah tanpa membawa gen transposase (Herrero et al. 1990). Analisis gen dari mutan B. japonicum sensitif asam-al dapat dilakukan dengan cara mengisolasi fragmen DNA yang mengapit transposon mini-tn5 menggunakan teknik inverse PCR. Tujuan Penelitian ini bertujuan melakukan analisis fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi B. japonicum terhadap cekaman asam-aluminium.

17 TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Bintil Akar Salah satu interaksi bakteri dengan tanaman yang paling penting dan menarik adalah antara tanaman legum dan bakteri dari genus Rhizobium, Bradyrhizobium, Shinorhizobium, Mesorhizobium dan Azorhizobium. Legum merupakan suatu kelompok besar tanaman yang memiliki nilai ekonomi penting seperti kedelai, semanggi (clover), alfafa, buncis, dan kapri. Rhizobium, Bradyrhizobium, Shinorhizobium, Mesorhizobium dan Azorhizobium adalah bakteri gram negatif motil yang berbentuk batang. Infeksi akar tanaman legum oleh spesies yang cocok dengan salah satu genus tersebut mengarah pada pembentukan bintil akar yang dapat mengubah nitrogen yang berupa gas menjadi nitrogen terikat, dan proses ini dinamakan fiksasi nitrogen. Pada umumnya bintil terbentuk pada akar tanaman, namun bintil juga dapat terbentuk pada batang, misalnya pada legum tropis Sesbania yang dinodulasi oleh Azorhizobium caulinodans. Tanaman ini tersebar di daerah tropis yang tanahnya seringkali mengalami defisiensi nitrogen (Madigan et al. 2003). Sekitar 90% dari seluruh spesies tanaman legum dapat mengalami nodulasi. Namun, terdapat spesifisitas antara legum dan galur Rhizobium. Suatu galur Rhizobium umumnya dapat menginfeksi spesies legum tertentu dan tidak pada spesies lainnya. Sekelompok galur Rhizobium yang dapat menginfeksi kelompok legum yang berkerabat dinamakan kelompok inokulasi silang. Walaupun galur Rhizobium mampu menginfeksi legum tertentu, tetapi tidak selalu dapat menghasilkan bintil yang memfiksasi nitrogen (Madigan et al. 2003). Genus Bradyrhizobium hanya memiliki satu tipe spesies, yaitu Bradyrhizobium japonicum (Holt et al. 1994). Menurut Perret et al. (2000), B. japonicum termasuk salah satu anggota famili Rhizobiaceae yang memiliki kisaran inang yang luas seperti pada tanaman anggota kelompok Aeschynomeneae (Papilionoideae), Arachis spp., Phaseoleae (Papilionoideae), Macroptilium, dan Vigna spp. Namun pada umumnya B. japonicum membentuk bintil akar pada jenis legum anggota kelompok Phaseoleae (Papilionoideae) dan Glycine spp.

18 5 B. japonicum memiliki karakteristik antara lain berbentuk batang dengan ukuran x µm, tidak membentuk spora, dapat membentuk granul poly-β-hidroksibutirat, motil dengan satu flagela polar atau subpolar, dan bersifat aerobik. Temperatur optimum pertumbuhannya berkisar antara o C sedangkan ph optimumnya 6-7 meskipun demikian galur yang berasal dari tanah asam dapat hidup di bawah ph optimum (Holt et al. 1994). Toleransi Bakteri Bintil Akar terhadap Cekaman Lingkungan Asam Simbiosis Rhizobium-legum dipengaruhi oleh penurunan ph tanah. Penurunan ph tanah tidak hanya menimbulkan peningkatan konsentrasi proton, tetapi juga kelarutan logam seperti aluminium yang bersifat toksik terhadap BBA. Respon BBA terhadap tanah asam tergantung pada interaksi sejumlah faktor diantaranya konsentrasi H +, aktivitas Al 3+ dan kemampuan kompetisi dan persistensi dari galur Rhizobium (Tiwari et al.1992). Isolasi dan karakterisasi BBA dilakukan untuk memperoleh galur yang toleran terhadap lingkungan asam. Adanya BBA yang toleran asam-al menjadi sumber eksplorasi materi genetik yang berperan dalam respon toleransi bakteri tersebut pada lingkungan asam. Telaah molekuler dilakukan dengan menggunakan mutan yang dihasilkan melalui mutagenesis dengan transposon seperti Tn5. Goss et al. (1990) melakukan karakterisasi mutan galur Rhizobium meliloti WSM419 yang dihasilkan melalui mutagenesis dengan Tn5. Galur liar R. meliloti WSM419 dapat bertahan hidup dan memiliki kemampuan nodulasi pada tanah asam (ph 5.6). Sementara itu galur mutannya menjadi sensitif terhadap asam dan tidak mampu tumbuh pada ph 5.6. Hal ini menunjukkan pada galur mutan telah kehilangan kemampuan untuk memelihara ph intraselulernya (phi). Hasil analisis fragmen DNA yang membawa Tn5 dan klon sekuen pengapit dari mutan tersebut menunjukkan lokus act (untuk acid tolerance) berada pada 4.4 kb dari fragmen yang dipotong dengan EcoRI. Selanjutnya Tiwari et al. (1992) melakukan karakterisasi mutan yang diinduksi dengan Tn5 dari galur-galur R. meliloti WSM419 dan R. leguminosarum WSM710. Hasil pemetaan melalui pemotongan dengan enzim restriksi pada WSM419 menunjukkan bahwa gen yang berperan dalam toleransi terhadap asam berada pada empat fragmen unik hasil

19 6 pemotongan dengan EcoRI. Pada galur mutan yang sensitif terhadap ph media di bawah 6.0 (TG2-6) dengan kandungan Ca 1 mm, dapat diperbaiki kemampuan ketahanan hidupnya pada ph media 5.5 dengan penambahan Ca 50 mm. Pada galur ini peningkatan konsentrasi Ca media dapat memperkecil penurunan phi. Sementara itu pada WSM710, dua gen yang berperan dalam toleransi terhadap asam berada pada fragmen hasil pemotongan dengan EcoRI yang terpisah yaitu pada 12 kb dan 16 kb. Karena galur-galur R. leguminosarum lebih toleran terhadap asam daripada WSM419, maka terdapat kemungkinan untuk transfer materi genetik dari galur yang lebih toleran ke galur yang kurang toleran. Analisis sekuen DNA yang terlibat dalam respon toleransi BBA terhadap lingkungan asam telah dipelajari pada R. tropici (Ricillo et al. 2000), R. leguminosarum bv. viciae, dan S. meliloti (Reeve et al. 2002). Hasil analisis gen yang mengalami penyisipan oleh Tn5-luxAB pada galur mutan R. tropici CIAT899-13T2 yang tidak mampu tumbuh pada kondisi asam, menunjukkan similaritas yang tinggi dengan gen gsh dari E. coli yang menyandikan enzim glutathion synthetase. Kelimpahan Kalium dan phi pada galur mutan tersebut lebih rendah dibandingkan tipe liarnya (Ricillo et al. 2000). Pada galur mutan R. leguminosarum bv. viciae, dan S. meliloti yang mengalami transposisi Tn5 pada gen actp mengalami hambatan ekspresi dari P-type ATPase yang termasuk subfamili CPx yang berperan dalam transport logam berat. Pada mutan yang mengalami knockout pada gen actp tersebut menunjukkan sensitivitas terhadap Cu. Hal ini menunjukkan adanya keterlibatan logam berat tersebut dalam mempertahankan ph media pada kondisi asam (Reeve et al. 2002). Selain itu ketahanan terhadap ph juga dipelajari pada E. coli yang memiliki kemampuan adaptasi terhadap perubahan lingkungannya. E. coli dapat tumbuh pada kisaran ph eksternal yang luas yaitu antara 5-9. Pada E. coli homeostasis ph tergantung pada konsentrasi K + eksternal (White et al. 1992). Arginin dekarboksilase yang disandikan oleh gen adi mengalami induksi pada ph asam, anaerobiosis, dan media kaya. Hasil analisis sekuen DNA yang berukuran 3 kb dari kromosom E. coli yang menyandikan arginin dekarboksilase menunjukkan bahwa sekuen ini menyandikan protein yang terdiri atas 755 asam amino dan berukuran Da, serta memiliki homologi dengan dekarboksilase

20 7 lain dari E. coli yaitu CadA (lisin dekarboksilase), SpeC (ornitin dekarboksilase biosintetik) dan SpeF (ornitin dekarboksilase biodegradatif) (Stim & Bennet 1993). Mutagenesis dengan Transposon pada Bakteri Masing-masing tipe bakteri membawa transposon yang unik, berikut ini adalah beberapa tipe transposon yang umum terdapat pada bakteri antara lain: (i) insertion sequence elements (elemen IS), (ii) transposon komposit, dan (iii) transposon nonkomposit (Snyder & Champness 1997). Elemen IS adalah transposon bakteri terkecil yang biasanya hanya berukuran bp dan hanya mengkode enzim transposase yang dibutuhkan dalam transposisinya. Elemen IS tidak membawa gen penanda seleksi dan ditemukan hanya karena elemen ini menimbulkan inaktivasi dari gen yang disisipinya. Pada E. coli secara alami ditemukan empat elemen IS yang berbeda yaitu IS1, IS2, IS3, dan IS4. Sampai saat ini telah ditemukan lebih dari 700 elemen IS pada bakteri, meskipun kebanyakan dapat digolongkan dalam 20 famili. Kadang-kadang dua elemen IS dari tipe yang sama membentuk transposon yang lebih besar, disebut tranposon komposit dengan membawa gen lain. Contoh tipe transposon komposit yaitu Tn5, Tn9, dan Tn10. Untuk transposon komposit Tn5 misalnya terdiri atas gen untuk resistensi terhadap kanamisin (Kan r ) dan resistensi streptomisin (Str r ) yang diapit oleh elemen IS yang disebut IS50. Transposon komposit bukan satu-satunya tipe transposon yang membawa gen-gen resistensi terhadap antibiotik. Gen-gen tersebut juga dapat menjadi bagian dari transposon nonkomposit. Gen-gen pada transposon nonkomposit diapit oleh suatu inverted repeat dan tipe transposon ini minimal terdiri atas satu gen resistensi saja. Contoh transposon nonkomposit adalah Tn3 yang memiliki gen resistensi terhadap ampisilin. Tidak semua tipe transposon dapat digunakan untuk mutagenesis. Suatu transposon yang digunakan dalam mutagenesis harus memiliki kelengkapan berikut ini: (i) memiliki kemampuan untuk berpindah dengan frekuensi yang tinggi, (ii) pemilihan sekuen targetnya tidak terlalu selektif, (iii) membawa gen

21 8 penanda seleksi sederhana, seperti resistensi terhadap antibiotik, dan (iv) dapat digunakan untuk transposisi ke berbagai macam bakteri yang berbeda (broad host range). Tn5 ideal digunakan untuk mutagenesis acak pada bakteri gram negatif karena memiliki kelengkapan di atas. Tn5 tidak hanya berpindah dengan frekuensi yang relatif tinggi, tetapi juga transposon ini hampir tidak ada spesifisitas dalam pemilihan targetnya dan mampu bertransposisi pada setiap bakteri gram negatif. Tn5 juga membawa gen resistensi terhadap kanamisin yang dapat terekspresi pada hampir semua bakteri gram negatif (Snyder & Champness 1997). Pada penelitian ini digunakan transposon mini-tn5 yang merupakan turunan dari transposon Tn5. Keistimewaan transposon ini adalah tidak membawa gen transposase yang berperan dalam proses transposisinya. Untuk proses transposisi dari mini-tn5, gen transposase dikonstruksi pada plasmid yang membawanya yaitu put (putmini-tn5) (Herrero et al. 1990). Setelah mini-tn5 mengalami transposisi (berpindah) dalam hal ini dari plasmid ke kromosom, tidak dapat melakukan transposisi kembali karena gen transposase-nya tetap berada di dalam plasmid put. Plasmid put merupakan turunan dari plasmid pgp704 dan memiliki origin of replication dari plasmid R6K yang hanya dapat dipelihara pada bakteri penghasil π protein. Plasmid ini juga membawa origin of transfer (orit) dari plasmid RP4, yang dapat menghasilkan transfer yang efisien ke sel resipien dari galur donor yang mengekspresikan fungsi konjugatif dari RP4 seperti E. coli SM10 (λ pir). put membawa gen tnp*, suatu mutan gen tnp dari IS50 R yang tidak memiliki situs NotI dan menyandikan transposase yang dibutuhkan untuk transposisi dari elemen mini-tn5 (Lorenzo et al. 1990). Penghilangan situs NotI tersebut tidak merubah struktur dari produk gen tnp. Gen transposase yang dimodifikasi (dengan menghilangkan situs NotI), dinamakan gen tnp* dan diklon pada situs SalI dari pgp704 derivatif dengan orientasi yang dapat mengatur proses transposisi secara optimal. Konstruksi ini dinamakan putkm. Plasmid putkm mengendalikan donor minitransposon dengan penanda resistensi terhadap antibiotik kanamisin (Herrero et al. 1990). Mini-Tn5 diapit oleh ujung I dan O yang terdiri atas 19 pasang basa. Elemen mini-tn5 kanamisin pada

22 9 put/km terdiri atas tiga Km r derivatif. Dua gen resistensi kanamisin berasal dari transposon Tn903 dengan orientasi yang berlawanan, sedangkan yang ketiga diisolasi dari Tn5 sendiri. Salah satu ciri penting dari elemen tersebut adalah hilangnya inhibitor transposase bersama dengan put setelah transposisi, sehingga satu galur resipien dapat digunakan untuk proses insersi berulang dengan menggunakan minitransposon yang memiliki penanda seleksi yang berbeda (Lorenzo et al. 1990). Gambar 1 menampilkan peta plasmid putmini-tn5km1 beserta transposon mini-tn5km1 yang digunakan dalam penelitian ini untuk melakukan mutagenesis dengan transposon melalui proses konjugasi. A) putmini-tn5km kb B) Gambar 1 (A) Peta plasmid putmini-tn5km1 (7.055 bp). (B) Transposon mini- Tn5Km1. Herrero et al. (1990) melaporkan hasil insersi transposon pada kromosom melalui proses konjugasi antara E. coli SM10(λ pir) dengan Pseudomonas putida. Dari hasil analisis pada 8 koloni ekskonjugan menunjukkan bahwa terjadi insersi tunggal pada masing-masing ekskonjugan, insersi transposon pada kromosom ekskonjugan terjadi pada lokasi yang berbeda, dan gen transposase tidak terdapat

23 10 pada ekskonjugan. Pada penelitian ini dilakukan mutagenesis dengan transposon mini-tn5km1 dari E. coli S17-1 (λ pir) ke B. japonicum toleran asam-al melalui proses konjugasi dan dari ekskonjugan yang diperoleh diharapkan terdapat mutan sensitif asam-al. Selanjutnya dari galur mutan sensitif dilakukan isolasi gen yang terlibat dalam toleransi asam-al pada B. japonicum.

24 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Research Center for Microbial Diversity (RCMD), Departemen Biologi, FMIPA, IPB dari bulan Januari sampai dengan Nopember Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tiga galur B. japonicum toleran asam-aluminium dengan nomor sandi galur BJ11, BJ38, dan KDR15. Ketiga galur tersebut digunakan sebagai resipien dalam konjugasi dan Escherichia coli S17-1 (λ pir) (putmini-tn5km1) digunakan sebagai donor dalam mutagenesis dengan transposon. Galur E. coli DH5 α digunakan sebagai inang dalam kloning fragmen DNA. Vektor plasmid pgem-t Easy digunakan untuk TA-cloning fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi asam-al. Metode Media dan Kondisi Pertumbuhan E. coli DH5 α secara rutin ditumbuhkan pada media Luria Bertani broth (LB) (tryptone 10.0 g/l, NaCl 10.0 g/l, yeast extract 5.0 g/l) tanpa antibiotik. E. coli S17-1 λ pir (putmini-tn5km1) secara rutin ditumbuhkan pada media LB yang mengandung ampisilin (100 µg/ml) dan kanamisin (50 µg/ml) pada suhu 37 o C. E.coli DH5 α yang membawa plasmid rekombinan pgem-t dikulturkan pada media LB yang mengandung ampisilin (100 µg/ml) dan kanamisin (50 µg/ml) pada suhu 37 o C. Galur BJ11, BJ38, dan KDR15 dikulturkan secara aerobik pada media yeast extract mannitol agar (YMA) (manitol 10.0 g/l, K 2 HPO g/l, MgSO 4 7H 2 O 0.2 g/l, NaCl 0.2 g/l, yeast extract 1.0 g/l). Penentuan Resistensi terhadap Antibiotik Tiga galur B. japonicum yang digunakan dalam penelitian ini dengan sandi BJ11, BJ38, dan KDR15 terlebih dahulu harus diketahui sensitivitasnya terhadap

25 12 beberapa antibiotik untuk menentukan penanda antibiotik yang akan dipakai dalam seleksi transkonjugan. Sebelum dilakukan pengujian pada media dengan antibiotik terlebih dahulu ketiga galur tersebut diremajakan pada media agar cawan YMA selama 7-8 hari pada suhu ruang. Selanjutnya masing-masing biakan tersebut digoreskan pada agar cawan YMA + Congo Red (CR) % + antibiotik. Antibiotik yang digunakan dalam pengujian ketiga galur tersebut yaitu ampisilin 50 µg/ml dan 100 µg/ml, kanamisin 25 µg/ml dan 50 µg/ml, rifampisin 25 µg/ml dan 50 µg/ml, serta tetrasiklin 25 µg/ml dan 50 µg/ml. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 7-8 hari dan diamati pertumbuhannya. Biakan yang tumbuh berarti resisten, sedangkan yang tidak tumbuh berarti sensitif terhadap antibiotik yang digunakan. Pengujian resistensi terhadap antibiotik tersebut juga dilakukan pada E. coli S17-1 (λ pir) pada media agar cawan Luria agar (LA). Penyiapan Kultur untuk Konjugasi Galur BJ11, BJ38, dan KDR15 masing-masing ditumbuhkan pada 50 ml media yeast extract mannitol broth (YMB) yang ditambah Rifampisin (50 µg/ml) dan dikocok dengan mesin pengocok (shaker) kecepatan 200 rpm pada suhu ruang dengan waktu inkubasi 60 jam sampai sel mencapai fase logaritmik ( 10 8 sel/ml). Galur E. coli S17-1 (λ pir) (putmini-tn5km1) ditumbuhkan pada 25 ml LB yang ditambah dengan kanamisin (50 µg/ml). Pengocokan dilakukan dengan kecepatan 200 rpm pada suhu 37 o C selama jam. Mutagenesis dengan Transposon Introduksi transposon mini-tn5km1 (putmini-tn5km1, 7055 bp) (Gambar 1) ke dalam sel B. japonicum dilakukan melalui konjugasi. Kultur B. japonicum dan E. coli yang telah mencapai fase logaritmik disentrifugasi dengan kecepatan 2300 g selama 3 menit dan peletnya dicuci sebanyak tiga kali dengan NaCl 0.85% untuk membersihkan sel dari sisa antibiotik. Pelet sel donor disuspensikan dalam 40 µl kaldu LB modifikasi (tryptone 5.0 g/l, NaCl 1.0 g/l, yeast extract 5.0 g/l) dan dicampurkan dengan pelet sel resipien dengan perbandingan yang sama (1:1) masing-masing dengan konsentrasi sekitar 10 8

26 13 sel/ml. Campuran ini selanjutnya diletakkan di atas filter nitroselulosa steril (ukuran pori 0.45 µm) pada media LA modifikasi. Pada media tersebut dibuat tiga juring sehingga pada tiap juring dapat diletakkan satu buah filter, masingmasing untuk donor (D), resipien (R), dan campuran antara D dan R (M). Gambar 2 memperlihatkan diagram skematik dalam melakukan mutagenesis dengan transposon. Mating dilakukan secara aerobik pada suhu ruang dengan tiga waktu lama inkubasi yaitu 12, 18, dan 24 jam. Selanjutnya filter diangkat dan dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi 1 ml garam fisiologis (NaCl 0.85%) dan divorteks. Masing-masing suspensi sel sebanyak 100 µl disebarkan pada media YMA ditambah kanamisin (50 µg/ml) dan rifampisin (50 µg/ml). Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 5-8 hari dan dihitung frekuensi transkonjugasinya. E. coli S17-1 (λ pir) B. japonicum Gambar 2 Mutagenesis dengan transposon dari sel E. coli S17-1 (λ pir) (putmini-tn5km1) ke sel B. japonicum melalui proses konjugasi.

27 14 Seleksi Mutan B. japonicum Sensitif asam-al Koloni transkonjugan hasil sebar yang telah tumbuh pada media YMA + CR % + rifampisin (50 µg/ml) + kanamisin (50 µg/ml) direplika pada media yang sama dan diseleksi sensitivitasnya terhadap asam-al dengan menggunakan media agar asam-al Ayanaba (ph 4.5 ditambah 50 µm Al) yang komposisinya dibuat sesuai dengan komposisi Ayanaba et al. (1983) (Tabel Lampiran 1). Transkonjugan yang tidak tumbuh pada media tersebut adalah mutan dari B. japonicum yang sensitif asam-al. Uji Pembentukan Bintil Akar Galur-galur mutan B. japonicum sensitif asam-al hasil konjugasi, masingmasing diuji kemampuannya untuk membentuk bintil akar. Uji pembentukan bintil akar pada tanaman siratro (Macroptilium atropupureum) menggunakan metode tabung sedangkan untuk pembentukan bintil akar pada tanaman kedelai (Glycine max) digunakan botol Leonard berdasarkan metode Vincent yang dimodifikasi seperti yang telah dilaporkan Wahyudi (1998). Uji Pembentukan Bintil Akar pada Tanaman Siratro. Biji siratro yang telah dipilih (tidak luka, tidak keriput, tidak terapung, dan memiliki ukuran seragam) ditoreh kulit bijinya dengan silet untuk menghilangkan masa dormansinya. Sterilisasi permukaan biji dilakukan dengan cara merendam biji berturut-turut dalam alkohol 95% selama 10 detik, H 2 O 2 5% selama 5 menit, dan dibilas dengan akuades steril sebanyak 7 kali. Biji selanjutnya dikecambahkan dalam cawan petri berisi kertas saring steril yang telah dibasahi akuades steril. Perkecambahan dilakukan selama 2 hari pada suhu ruang dalam keadaan gelap. Sementara itu media agar tegak (20 ml) disiapkan dalam tabung berukuran 25x200 mm. Media agar tersebut terdiri atas larutan hara yang komposisinya dibuat berdasarkan komposisi Ahmed & Evans (Speidel & Wollum 1980) (Tabel Lampiran 2) yang telah dimodifikasi dan ditambahkan agar Bacto 0.85%. Kecambah siratro yang berumur 2 hari ditanam secara aseptik pada tabung agar tegak tersebut masing-masing satu kecambah. Setelah kecambah berumur 2 hari di dalam tabung (4 hari) dilakukan inokulasi B. japonicum mutan dan galur liarnya. Suspensi inokulum disiapkan dengan cara meremajakan galur pada

28 15 media agar YMA miring selama 8 hari. Selanjutnya ke dalam biakan ditambahkan 1 ml garam fisiologis steril untuk mendapatkan seluruh suspensi dengan tingkat kekeruhan sekitar 10 9 sel/ml dan diinokulasikan ke dalam tabung agar tegak yang telah ditumbuhi kecambah siratro. Tabung-tabung tersebut kemudian dibenamkan kurang lebih setinggi media agar tegak dalam bak pasir yang telah dibasahi air dan disimpan di rumah kaca. Suhu pasir dijaga agar tidak lebih dari 30 o C dengan cara menyiram pasir setiap 2-3 hari sekali. Pengamatan bintil akar yang terbentuk dilakukan mulai hari ke-5 sampai ke-30 setelah inokulasi. Uji Pembentukan Bintil Akar pada Tanaman Kedelai. Biji kedelai dipilih, disterilisasi, dan dikecambahkan dengan perlakuan yang sama seperti yang dilakukan pada biji siratro. Kecambah yang berumur dua hari selanjutnya ditanam dalam botol Leonard. Media yang digunakan berupa pasir dan arang. Pasir yang digunakan adalah yang tertahan ayakan yang berukuran 50 mesh (0.31 mm) dan lolos ayakan 30 mesh (0.52 mm), yang sebelumnya telah dicuci dengan air bersih 10 kali dan dikeringkan. Arang yang digunakan adalah tumbukan arang yang tertahan ayakan 28 mesh dan lolos ayakan 3 mm. Perbandingan pasir dan arang 3:1 dan setiap botol diisi 480 gram. Botol Leonard modifikasi terdiri atas dua botol kecap atau bir volume 700 ml. Salah satu botol dipotong dan pada bagian dasarnya digunakan untuk media penumbuhan yang berisi pasir dan arang. Botol lainnya dipotong pada bagian leher dan digunakan sebagai tandon untuk larutan hara. Botol yang berisi campuran pasir dan arang diletakkan di atas botol tandon yang berisi larutan hara. Masing-masing botol diisi 300 ml larutan hara bebas N menurut Alva et al. (1988) (Tabel Lampiran 3) dan 100 ml disiramkan ke atas campuran pasir dan arang. Botol bagian atas ditutup dengan aluminium foil. Selanjutnya seluruh botol ditutup dengan kertas semen dan dilakukan sterilisasi pada suhu 121 o C selama 2 jam. Biji kedelai yang dikecambahkan ditanam pada media pasir-arang dengan tandon yang berisi larutan hara dalam botol Leonard. Untuk tiap botol ditanam dua kecambah. Bersamaan dengan penanaman juga diinokulasikan suspensi B. japonicum mutan dan tipe liarnya sebanyak 1 ml (dengan menambahkan garam fisiologis pada biakan hingga kepekatan sel sekitar 10 9 sel/ml). Permukaan botol selanjutnya ditutup kembali dengan aluminium foil

29 16 dan diletakkan dalam ruangan pada suhu kamar 2-3 hari (sampai ujung atas kecambah menyentuh aluminium foil). Permukaan aluminium foil dibuka dan selanjutnya botol tersebut diletakkan di rumah kaca. Larutan hara bebas N ditambahkan setiap dua hari sekali dan tanaman dipelihara hingga 30 hari setelah inokulasi. Isolasi DNA Genom Mutan B. japonicum Sensitif Asam-Al Mutan B. japonicum dikulturkan pada media YMB (50 ml) yang ditambah kanamisin (50 µg/ml) dan rifampisin (50 µg/ml), dan diinkubasi pada suhu ruang sampai mencapai fase logaritmik. Selanjutnya isolasi DNA genom dilakukan dengan menggunakan metode CTAB (Sambrook & Russel 2001). Sel kemudian dipanen dengan mengambil sebanyak 50 ml kultur dan disentrifugasi dengan kecepatan 9000 g selama 10 menit. Kemudian pelet dipindahkan pada tabung eppendorf steril dan dicuci 2-3 kali dengan 250 µl buffer TE 1x. Pelet diresuspensi dalam 250 µl buffer TE 1x, 50 µl SDS 10%, dan 10 µl proteinase K (10 mg/ml), dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 jam. Selanjutnya suspensi ditambah dengan 80 µl NaCl 5 M dan 100 µl CTAB (suhu 65 o C), dan diinkubasi selama 20 menit dalam penangas air pada suhu 65 o C. Suspensi lalu ditambah dengan 600 µl fenol-kloroform-isoamilalkohol (25:24:1), dikocok kuat dan disentrifugasi pada kecepatan g selama 15 menit. Fase cair diambil dan dicampur kloroform-isoamilalkohol (24:1) dengan volume yang sama, dan disentrifugasi dengan kecepatan g selama 15 menit. Selanjutnya supernatan dipresipitasi dengan etanol absolut dingin sebanyak 2x volume supernatan dan dicampur dengan hati-hati. DNA hasil presipitasi diinkubasi di es selama 30 menit, dicuci dengan etanol 70% dan disentrifugasi dengan kecepatan g selama 10 menit. Pelet DNA dikeringudarakan dan dilarutkan dalam 20 µl ddh 2 O yang mengandung RNase 1% dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 15 menit.

30 17 Isolasi DNA Pengapit Transposon dengan Inverse Polymerase Chain Reaction (Inverse PCR) Untuk mengamplifikasi DNA genom yang mengapit transposon digunakan metode seperti yang diterangkan Wahyudi et al. (2001) yang dimodifikasi (Gambar 3), seperti diuraikan berikut ini. Preparasi DNA Cetakan (Template). DNA cetakan untuk inverse PCR disiapkan dari sekitar 1 µg DNA genom mutan B. japonicum sensitif asam-al yang dipotong dengan EcoRV (enzim restriksi ini tidak memotong mini- Tn5Km1). DNA hasil pemotongan diekstrak dengan fenol-kloroformisoamilalkohol dan dipresipitasi dengan etanol absolut yang mengandung 0.1 volume Na-asetat 3 M ph 4.6. DNA selanjutnya dicuci dua kali dengan etanol 70% dan disentrifugasi dengan kecepatan g. Pelet DNA dilarutkan dalam 5 µl ddh 2 O steril dan seluruhnya diligasi menggunakan T 4 DNA ligase sebanyak 3 Weiss unit (Promega, USA). Campuran ligasi diinkubasi semalam pada suhu 4 o C. Selanjutnya DNA sirkuler digunakan sebagai cetakan dalam inverse PCR. Kondisi Inverse PCR. Fragmen DNA genom yang mengapit transposon mini-tn5 (sekitar 0.5 µg) diamplifikasi menggunakan Gene Amp PCR 2400 (Perkin Elmer, USA) dalam campuran reaksi dengan volume total 50 µl yang mengandung 2.5 mm dntp mixture, GC buffer II, LA Taq DNA polimerase 2.5 unit dan primer yang didesain dari sekuen mini-tn5km1 yang diarahkan keluar dari tranposon. Primer (P1: 5 -ACA CTG ATG AAT GTT CCG TTG-3 dan P2: 5 -ACC TGC AGG CAT GCA AGC TTC-3 ) masing-masing 100 pmol digunakan untuk mengamplifikasi sekuen DNA yang mengapit transposon upstream dan downstream. Denaturasi DNA sampel dilakukan pada suhu 95 o C selama 2 menit, annealing pada suhu 58 o C selama 1 menit dan elongation pada suhu 72 o C selama 1 menit dan 10 menit untuk siklus yang terakhir. DNA diamplifikasi sebanyak 30 siklus (Gambar 3). Produk inverse PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1% untuk mengetahui ukuran fragmen yang diamplifikasi.

31 18 Gambar 3 Strategi amplifikasi DNA genom pengapit transposon dengan inverse PCR (Wahyudi et al. 2001). Purifikasi Produk Inverse PCR Produk inverse PCR dielektroforesis dan fragmen DNA diisolasi dari gel agarosa 0.8%. Fragmen DNA diisolasi dan dipurifikasi dengan menggunakan Wizard SV Gel & PCR Clean-up System (Promega, USA). Setelah elektroforesis, gel yang berisi pita DNA yang dikehendaki dipotong dan hasil cacahan dari gel tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml. Kemudian ke dalam tabung tersebut ditambahkan 10 µl membrane binding solution per 10 mg cacahan gel, lalu divorteks dan diinkubasi pada suhu o C sampai gel benar-benar larut. Setelah melarutkan gel dilakukan pengikatan DNA dengan memasukkan campuran gel ke dalam tabung penampung yang dilengkapi dengan minikolom dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit. Selanjutnya tabung penampung tersebut disentrifugasi pada kecepatan g selama 1 menit, cairan yang

32 19 melewati minikolom dibuang dan minikolom dimasukkan kembali pada tabung penampung. Proses pencucian dilakukan dengan menambahkan 700 µl membrane wash solution yang mengandung etanol dan disentrifugasi pada kecepatan g selama 1 menit. Cairan dibuang dan minikolom dimasukkan kembali dalam tabung penampung. Tahap pencucian diulang dengan menambahkan 500 µl membrane wash solution dan disentrifugasi kembali pada kecepatan yang sama selama 5 menit. Untuk proses elusi, minikolom dipindahkan dengan hati-hati pada tabung mikro yang baru dan ditambahkan 50 µl air bebas nuklease pada minikolom. Lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit dan disentrifugasi pada kecepatan g selama 1 menit. Minikolom dibuang dan DNA disimpan pada suhu 20 o C. Kloning Produk Inverse PCR Produk inverse PCR yang telah dimurnikan diligasikan dengan vektor plasmid pgem-t Easy (TA-cloning, Promega, WI, USA) membentuk plasmid rekombinan, pgemt-11. Reaksi diinkubasi pada suhu 4 o C semalam. DNA hasil ligasi ini kemudian ditransformasikan ke E. coli DH5 α dengan menggunakan metode heat shock-cacl 2 dingin (Sambrook & Russel 2001). Penyiapan Sel Kompeten. Sel E. coli DH5 α yang kompeten disiapkan terlebih dahulu sebelum melakukan transformasi. E. coli DH5 α ditumbuhkan pada media LB dan diinkubasi semalam pada suhu 37 o C, kemudian dilakukan subkultur pada media LB (1% kultur diinokulasikan pada 25 ml LB) dengan suhu yang sama selama 3 jam. Sebanyak 1.5 ml kultur disentrifugasi dengan kecepatan 2300 g selama 2 menit. Pelet yang diperoleh diresuspensi dengan 1 ml larutan CaCl 2 dingin (CaCl M, Tris HCl 5 mm, dan MgCl 2 5 mm; ph 7.0) dan diinkubasi di es selama 20 menit. Suspensi sel tersebut kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 2300 g selama 2 menit. Selanjutnya pelet diresuspensi kembali dalam 200 µl larutan CaCl 2 dingin dan diinkubasi di es selama 10 menit. Tranformasi Plasmid Rekombinan. Transformasi dilakukan dengan menambahkan 3-5 µl DNA hasil ligasi ke dalam 200 µl sel kompeten dan diinkubasi di es selama 30 menit (setiap 15 menit tabung eppendorf dijentik). Kemudian proses heat shock dilakukan pada suhu 42 o C selama 1 menit dan

33 20 tabung eppendorf langsung dimasukkan kembali ke dalam es selama 2 menit. Sel dipulihkan dengan menambahkan 250 µl LB dan dishaker dengan kecepatan 200 rpm pada suhu 37 o C selama 1 jam. Seluruh campuran disentrifugasi dengan kecepatan 2300 g selama 2 menit. Pelet diresuspensi kembali dalam 200 µl LB dan dicawankan pada media LA + ampisilin (100 µg/ml) + X-gal (40 µg/ml) dan diinkubasi pada suhu 37 o C semalam. Seleksi transforman dilakukan pada media LA + ampisilin (100 µg/ml) + X-gal (40 µg/ml) dan diinkubasi pada suhu 37 o C semalam. Koloni putih diambil dan dikulturkan pada media LB yang ditambah ampisilin (100 µg/ml) untuk verifikasi plasmid rekombinan. Plasmid rekombinan pgemt-11 diisolasi dengan metode lisis alkalin (Sambrook & Russel 2001) yang dimodifikasi (Wahyudi, Komunikasi pribadi) seperti diterangkan berikut ini. Plasmid rekombinan dipotong dengan EcoRI, kemudian hasilnya dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Fragmen DNA sisipan diamplifikasi kembali dengan menggunakan plasmid rekombinan sebagai cetakan dan primer yang sama dengan amplifikasi DNA pengapit transposon. Isolasi DNA Plasmid Rekombinan Plasmid rekombinan, pgem-t membawa fragmen produk inverse PCR, diekstrak dari E. coli DH5 α menggunakan metode alkalin lisis (Sambrook & Russel 2001). Sel E. coli DH5 α yang membawa plasmid rekombinan dikulturkan semalam pada suhu 37 o C. Kemudian 1.5 ml kultur disentrifugasi dengan kecepatan 2300 g selama 2 menit. Pelet diresuspensi dengan 100 µl larutan 1 (10 mm Tris-Cl, 1 mm EDTA; ph 8.0 dan 50 mm glukosa). Selanjutnya ditambahkan 125 µl larutan 2 (SDS 1% dalam 0.2 M NaOH) dan suspensi dibolak-balik secara perlahan sampai terjadi lisis. Sebanyak 375 µl larutan 3 (Kasetat 5 M dan asam asetat glasial) ditambahkan dan dibolak-balik secara perlahan. Kemudian campuran tersebut disentrifugasi pada kecepatan g selama 10 menit. Supernatan diekstraksi dengan menggunakan fenol-kloroformisoamilalkohol (25:24:1), dikocok kuat, dan disentrifugasi pada kecepatan g selama 10 menit. Fase cair dipindahkan ke tabung eppendorf yang baru dan diendapkan dengan menambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2x volume supernatan dan 0.1 volume Na-asetat 3 M ph 4.6. DNA hasil presipitasi

34 21 diinkubasi di es selama 30 menit, dicuci dengan etanol 70% dan disentrifugasi dengan kecepatan g selama 10 menit. Pelet DNA dikeringudarakan dan dilarutkan dalam 20 µl ddh 2 O yang mengandung RNase 1% dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 15 menit. Selanjutnya DNA disimpan pada suhu 20 o C. Analisis Sekuen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-Al Sekuensing fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi asam-al dilakukan pada kedua utas menggunakan metode dideoksi menggunakan primer universal M13 (forward dan reverse) digunakan untuk cycle sequencing. Plasmid rekombinan digunakan sebagai template untuk sekuensing yang dilakukan dengan meggunakan DNA Sequencer ABI310 (Applied Biosystems, USA) yang dilakukan di Fakultas Bioteknologi Universitas Atmajaya Jakarta. Analisis sekuen DNA genom pengapit transposon dilakukan menggunakan program BLASTX (Gish & States 1993) melalui situs European Bioinformatics Institute (EBI) dengan alamat untuk mengetahui homologinya dengan protein-protein yang ada di basis data (database).

35 HASIL Penentuan Resistensi terhadap Antibiotik Ketiga galur B. japonicum BJ11, BJ38, dan KDR15 menunjukkan kemampuannya tumbuh pada media YMA + CR % yang mengandung antibiotik ampisilin, rifampisin atau tetrasiklin (Tabel 1). Namun demikian ketiga galur tersebut tidak mampu tumbuh pada media YMA + CR % + kanamisin (50 µg/ml). E. coli S17-1 (λ pir) dengan konsentrasi antibiotik yang sama mampu tumbuh pada media LA yang mengandung ampisilin ataupun kanamisin, tetapi tidak mampu tumbuh pada media LA yang mengandung rifampisin ataupun tetrasiklin (Tabel 1). Hal ini disebabkan karena E. coli S17-1 (λ pir) membawa plasmid putmini-tn5km1 yang membawa gen resistensi terhadap kanamisin dan ampisilin (Gambar 1). Tabel 1 Pertumbuhan galur B. japonicum dan E. coli pada media agar yang mengandung antibiotik Sandi galur BJ11 BJ38 KDR15 E.c S17-1 λpir Ampisilin Kanamisin Rifampisin Tetrasiklin Keterangan : + = tumbuh; - = tidak tumbuh; konsentrasi antibiotik yang digunakan dalam µg/ml Gambar 4 memperlihatkan penampilan pertumbuhan ketiga galur B. japonicum (BJ11, BJ38, dan KDR15) pada media YMA + CR % + rifampisin 50 µg/ml setelah diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang. Ketiga galur tersebut memiliki tipe koloni Large Watery atau berair pada masa inkubasi 8 hari.

36 23 Gambar 4 Penampilan pertumbuhan B. japonicum toleran asam-al galur BJ11, KDR15, dan BJ38 pada media YMA + CR % + rifampisin 50 µg/ml setelah inkubasi selama 8 hari pada suhu ruang. Berdasarkan kemampuan tumbuh galur-galur tersebut pada media agar yang mengandung antibiotik, pada penelitian ini dapat ditentukan media YMA + CR % + kanamisin (50 µg/ml) + rifampisin (50 µg/ml) digunakan sebagai media seleksi hasil konjugasi. Karena galur-galur B. japonicum sensitif terhadap kanamisin tetapi resisten rifampisin, sedangkan E. coli resisten kanamisin tetapi sensitif terhadap rifampisin, maka hasil seleksi pada proses konjugasi adalah koloni B. japonicum yang tumbuh pada media seleksi tersebut. Mutagenesis dengan Transposon dan Seleksi Mutan B. japonicum Sensitif Asam-Al Transposon mini-tn5km1 yang dibawa plasmid put dalam E. coli S17-1 (λ pir) telah berhasil ditransfer ke B. japonicum toleran asam-al melalui konjugasi. Konjugasi bakteri dilakukan pada tiga waktu inkubasi mating yaitu 12, 18, dan 24 jam. Frekuensi tertinggi dicapai oleh galur BJ11 pada waktu inkubasi mating 24 jam sebesar 7.1x10-6 sel/resipien, sedangkan frekuensi terendah dicapai oleh galur BJ38 sebesar 6.1x10-8 pada waktu inkubasi mating 12 jam (Tabel 2). Frekuensi konjugasi dari galur BJ11 dan KDR15 cenderung meningkat sampai waktu inkubasi mating 24 jam. Untuk galur BJ38 frekuensi konjugasinya meningkat sampai waktu inkubasi mating 18 jam dan mengalami penurunan

37 24 setelah waktu inkubasi 24 jam. Berdasarkan hasil konjugasi pada ketiga galur B. japonicum tersebut dengan menggunakan donor E. coli S17-1 (λ pir) terlihat bahwa penambahan lama waktu inkubasi mating dapat dilakukan antara jam untuk mendapatkan frekuensi konjugasi yang lebih tinggi dibandingkan waktu inkubasi 12 jam. Tabel 2 Frekuensi konjugasi putmini-tn5km1 dari E. coli S17-1 (λ pir) ke B. japonicum pada tiga waktu inkubasi mating yang berbeda Konjugasi Bakterial BJ11 x E. coli S17-1 λpir BJ38 x E. coli S17-1 λpir KDR15 x E. coli S17-1 λpir Frekuensi konjugasi (sel/resipien) 12 jam 18 jam 24 jam 6.7x x x x x x x x x10-6 Koloni transkonjugan yang diperoleh dari hasil konjugasi diuji sensitivitasnya pada media Ayanaba (ph 4.5; Al 50 µm) untuk menentukan koloni B. japonicum transkonjugan yang sensitif asam-al. Koloni transkonjugan yang sensitif tidak mampu tumbuh atau terhambat pertumbuhannya pada media asam-al, sedangkan koloni transkonjugan yang tetap toleran mampu tumbuh pada media tersebut. Koloni yang sensitif diduga telah mengalami penyisipan transposon pada gen yang terlibat dalam toleransi asam-al sehingga tidak mampu tumbuh pada media asam-al dan transkonjugan sensitif ini selanjutnya diberi nama mutan sensitif asam-al (acid-al sensitive= AAS). Hasil seleksi transkonjugan dari galur BJ11 dan BJ38 diperoleh masingmasing tiga mutan sensitif asam-al yaitu dengan sandi galur AAS11.1, AAS11.2, dan AAS11.5 yang dihasilkan dari galur BJ11 serta AAS38.1, AAS38.2, dan AAS38.3 yang dihasilkan dari galur BJ38. Hasil seleksi transkonjugan yang dihasilkan dari galur KDR15 diperoleh satu mutan sensitif asam-al dengan sandi galur AAS15.2. Selanjutnya satu mutan yang dihasilkan dari galur BJ11, yang didesain sebagai AAS11.2 digunakan sebagai model untuk analisis genetika molekuler toleransi asam-al pada B. japonicum.

38 25 Uji Pembentukan Bintil Akar B. japonicum termasuk spesies bakteri tumbuh lambat yang dapat membentuk bintil akar baik pada tanaman dari genus Macroptilium maupun Glycine (Perret et al. 2000). Ketiga galur B. japonicum BJ11, KDR15, dan BJ38 beserta mutannya dapat membentuk bintil pada tanaman siratro (Macroptilium atropupureum) atau kedelai (Glycine max). Galur BJ11, BJ38, dan AAS38.3 tidak mampu membentuk bintil pada tanaman siratro, tetapi mampu membentuk bintil pada tanaman kedelai. Gambar 5 menampilkan bintil akar yang terbentuk pada tanaman siratro yang diinokulasi dengan galur liar (wild type= WT) KDR15 dan mutannya (AAS15.2). Waktu yang dibutuhkan untuk membentuk bintil pada tanaman siratro lebih cepat (15 hari) dibandingkan pada tanaman kedelai (30 hari). Jumlah dan letak bintil yang terbentuk cenderung beragam pada masingmasing galur yang diuji (Tabel 3). A) B) Gambar 5 A) Bintil akar tanaman siratro yang terbentuk inokulasi dengan B. japonicum KDR15 (WT), dengan B) Bintil akar tanaman siratro yang terbentuk hasil inokulasi dengan mutan AAS15.2 (ditunjukkan dengan anak panah).