BAB III METODE PENELITIAN. Teknologi Universitas Airlangga, Laboratorium Kimia Fisik-Analitik Fakultas

Transkripsi

1 24 BAB III METODE PENELITIAN 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Waktu penelitian ini akan dilaksanakan selama 6 (enam) bulan dimulai pada bulan Juli sampai bulan Desember tahun Tempat penelitian untuk pembuatan sampel dilakukan di Laboratorium Fisika Material Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga, Laboratorium Kimia Fisik-Analitik Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga dan uji sitotoksisitas dilakukan di Pusat Veterinaria Farma (PUSVETMA), Jl Ahmad Yani, Surabaya Bahan dan Alat Penelitian Bahan Penelitian Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini antara lain : Nanopartikel hidroksiapatit dalam bentuk serbuk (Nanoparticles of hydroxyapatite powder), Kitosan serbuk (Chitosan powder), Methanol, Asam asetat 2%, Ortho-phosporic acid, Gas nitrogen dan Aquades Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam pembuatan sampel antara lain : Botol tiga leher, Stirrer, Termometer, Heater (hot plate), Condenser, Pipet, Gelas ukur, Tabung erlenmeyer, Gelas petri, Gelas beker, Neraca digital, Tabung reaksi, Corong, Spatula (pengaduk), Vacum oven dan vacum desicator. Alat yang digunakan untuk pengujian sampel antara lain : Spektrofotometer dengan Software Elisa Reader.

2 Prosedur Penelitian Pada penelitian ini akan dilakukan dalam beberapa tahap pelaksanaan. Skema pelaksanaan penelitian dapat dilihat pada gambar 3.1. Persiapan dan Proses Variasi Konsentrasi n-ha/cs Proses Sintesis Kitosan Proses Sintesis nano-komposit n-ha/cs Proses pembuatan Sampel Uji Sel Fibroblas dengan metode Kultur Cell lines Uji enzimatik dengan pereaksi MTT ((3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) Uji Sitokompatibili Spektrofotometer dengan Software Elisa Reader Analisis Data Gambar 3.1 Skema Pelaksanaan Penelitian

3 Tahap Persiapan Alat dan Bahan Tahap awal dari penelitian adalah persiapan alat dan bahan yang akan digunakan serta penentuan komposisi bahan-bahan yang dibutuhkan. Penentuan komposisi bahan-bahan yang dibutuhkan dalam sintesis nanokomposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/cs) adalah dengan melihat perbandingan variasi massa (w/w)% antara nanopartikel hidroksiapatit (n-ha) dan kitosan. Dengan mengetahui variasi massa (w/w)% dapat diketahui berapa gram yang dibutuhkan dalam pembuatan sampel uji. (a) (b) Gambar 3.2 Bahan Dasar Nanokomposit Hidrosiapatit/Kitosan (nha/cs); (a) Nanoparticles of hydroxyapatite powder; (b) Chitosan from shrimp shells Rumus umum yang digunakan dalam penentuan massa adalah :... (3.1) Variasi massa (w/w)% dalam nano-komposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/cs) masing-masing dapat dilihat pada table (3.1).

4 27 Tabel 3.1 Variasi Massa (w/w)% n-ha/cs Kode Sampel (wt)% n-ha Massa n-ha (gram) Massa Kitosan (gram) Massa Komposit (gram) I II III IV V VI Proses Sintesis Kitosan Tahap selanjutnya sebelum dilakukan proses sintesis nanokomposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/cs) adalah proses sintesis kitosan. Langkah yang dilakukan adalah kitosan diperoleh dengan melarutkan 2 gram chitosan powder (chitosan from shrimp shells) dalam 100 ml asam asetat 2% dan 6 gram orthophosphoric acid 85%. Campuran yang diperoleh dipanaskan dengan proses reflux menggunakan botol tiga leher (three naked-round bottomed flask equipped with a stirrer, condenser, thermometer and nitrogen gas inlet tube) pada suhu 80 o C selama 2 jam dan dibawah pengadukan konstan. Proses reflux (gambar 3.3) merupakan gabungan antara proses pemanasan cairan dan pendinginan uap, tetapi kondensat yang terbentuk dikembalikan ke dalam labu didih.

5 28 2 gram Chitosan from shrimp shells + CH 3 COOH 2% + 6 gram H 3 PO 4-85% Gambar 3.3 Proses Reflux Hasil dari sintesis kemudian didinginkan dan diendapkan dalam larutan methanol berlebih. Proses pengendapan dalam methanol merupakan proses pengendapan berulang untuk menghapus semua H 3 PO 4 dan asam asetat yang tidak bereaksi (pada proses pengendapan kedua endapan gel dilarutkan dalam aquades kemudian dalam larutan methanol berlebih). Gel yang terbentuk dikumpulkan dan dikeringkan dalam vaccum oven pada suhu 80 o C selama lebih dari semalam Proses Sintesis Nano-komposit Hidroksiapatit/Kitosan (n-ha/cs) Pembuatan nanokomposit hidroksiapatit/kitosan (n-hap/csp) dilakukan dengan metode pencampuran sederhana. Pertama, sebuk kitosan dilarutkan dalam air panas, dan kemudian nanopartikel hidroksiapatit ditambahkan secara perlahanlahan. Enam sampel uji nanokomposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/cs) dibuat dengan menambahkan partikel n-ha masing-masing 10%, 20%, 30%, 40%, 50%

6 29 dan 60% pada enam sampel uji larutan kitosan. Perbandingan komposisi nanopartikel hidroksiapatit yang akan ditambahkan dalam larutan kitosan 80% : 20%. Campuran tersebut diaduk dengan bantuan mechanical stirrer selama 1 jam dengan kecepatan 3000 rpm. Setelah semua nanopartikel hidroksiapatit ditambahkan ke dalam larutan polimer, solusi yang dihasilkan disimpan dalam vaccum desiccator untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara. Bubur yang dihasilkan dari proses tersebut kemudian dituangkan ke dalam cawan petri dan dikeringkan dalam vaccum oven pada suhu 90 o C selama lebih dari semalam. Hasil akhir dari sintesis ini berupa film, yang masing-masing sampel akan diuji karakterisktik dan sifat toksisitasnya Pengujian Sitotoksisitas Sampel yang telah dibuat selanjutnya dilakukan uji sitotoksik. Sel kultur yang digunakan adalah Sel BHK 21 (Baby Hamster Kidney 21) clone 13. Sebelumnya sel disimpan pada suhu -85 dalam botol nunc dengan media eagle (gambar 3.4), dilakukan thawing ditempatkan dalam inkubator pada suhu 37 C hingga mencair. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit, endapan merupakan kultur sel, sedang media penyimpanan berada di bagian atas dan dibuang. Kultur sel ± 20 ml dimasukkan kedalam botol roux kecil ditambah dengan media penumbuh eagle dan ditambah serum sapi 10%, kemudian dimasukkan kedalam inkubator CO 2 dengan suhu 37 C selama 2 x 24 jam, sel akan penuh.

7 30 Gambar 3.4 Kultur sel BHK 21 Kultur sel dibagi dalam micro plate 96 well masing-masing 1,5 ml ditambah media eagle dan serum sapi 10%, kemudian dimasukkan dalam inkubator CO 2 dengan suhu 37 C selama 2 x 24 jam. Setelah confluent media dibuang dan dicuci dengan larutan PBS 2 kali, kultur monolayer yang sudah bersih selnjutnya ditambahkan kembali dengan media eagle dan EMS 5%, kemudian semua micro plate tersebut disimpan lagi dalam inkubator CO 2 selama 24 jam. Kultur sel yang telah monolayer dikeluarkan dari inkubator CO 2, kemudian media dibuang dan dicuci dengan PBS 5 kali untuk membersihkan sisa hasil metabolisme sel. Kemudian kultur sel ditrypsinasi dengan versence trypsin 0,25% untuk merontokkan sel yang melekat pada dinding botol. Setelah ditambah dengan MTT, kultur sel diinkubasi selama 24 jam lalu ditambah DMSO (dimetil Sulfoxida). Setelah 15 menit, kultur sel di shaker lalu dibaca menggunakan Spektrofotometer Elisa Reader.