KERAGAMAN DNA MIKROSATELIT LOKUS ILSTS073, ILSTS030 DAN HEL013 PADA SAPI KATINGAN DI KALIMANTAN TENGAH SKRIPSI RAHMAH MUTHMAINNAH

Transkripsi

1 KERAGAMAN DNA MIKROSATELIT LOKUS ILSTS073, ILSTS030 DAN HEL013 PADA SAPI KATINGAN DI KALIMANTAN TENGAH SKRIPSI RAHMAH MUTHMAINNAH DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011 i

2 RINGKASAN RAHMAH MUTHMAINNAH. D Keragaman DNA Mikrosatelit Lokus ILSTS073, ILSTS030 dan HEL013 pada Sapi Katingan di Kalimantan Tengah. Skripsi. Mayor Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan. Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama : Prof. Dr. Ir. Ronny Rachman Noor, M. Rur. Sc. Pembimbing Anggota : Dr. Jakaria, S.Pt. M.Si. Sapi Katingan adalah salah satu plasma nutfah ternak di Kabupaten Katingan, Kalimantan Tengah dan dipelihara oleh masyarakat di sepanjang aliran sungai Katingan. Penelitian ini perlu dilakukan karena adanya keterbatasan informasi genetik, khususnya pada tingkat molekuler (DNA mikrosatelit). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman DNA mikrosatelit lokus ILSTS073, ILSTS030 dan HEL013 pada sapi Katingan di Kalimantan Tengah. Sampel darah diambil dari 70 ekor sapi Katingan yang berasal dari tiga populasi, yaitu populasi Buntut Bali, Pendahara dan Tumbang Lahang masingmasing 26 ekor, 13 ekor dan 31 ekor. Amplifikasi DNA mikrosatelit dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) kemudian dielektroforesis menggunakan gel poliakrilamid 6% dan dilanjutkan dengan pewarnaan perak. Data yang diperoleh dianalisis berdasarkan frekuensi alel, frekuensi genotipe, derajat heterozigositas dan pohon genetik. Hasil amplifikasi lokus ILSTS073 menghasilkan 13 macam alel yaitu alel A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, M dan N. Frekuensi alel tertinggi yaitu alel E (0,5208) pada populasi Pendahara dan terendah yaitu alel C dan N pada populasi Tumbang Lahang. Frekuensi genotipe tertinggi adalah genotipe EE (0,3333) pada populasi Pendahara dan Tumbang Lahang dan terendah yaitu genotipe CD, DD, DE, EE FH, HH, EK, FK dan HN (0,0333) pada populasi Tumbang Lahang. Lokus ILSTS030 menghasilkan 10 macam alel yaitu alel A, B, C, D, E, F, G, H, I dan J. Frekuensi alel tertinggi adalah alel E (0,5167) pada populasi Tumbang Lahang dan terendah adalah alel C dan N (0,0167) pada populasi Tumbang Lahang. Frekuensi genotipe tertinggi adalah genotipe GG (0,3000) pada populasi Tumbang Lahang dan terendah yaitu genotipe AB, CC, BD, BF, AG, DG dan IJ (0,0333) pada populasi Tumbang Lahang. Lokus HEL013 menghasilkan 12 macam alel yaitu alel B, C, D, E, F, G, H, I, L, N, O dan P. Frekuensi alel tertinggi adalah alel F (0,4615) pada populasi Buntut Bali dan terendah adalah alel I dan L (0,0167) pada populasi Tumbang Lahang. Frekuensi genotipe tertinggi adalah genotipe FN (0,7000) pada populasi Tumbang Lahang dan terendah yaitu genotipe EE, GI, EL dan GN (0,0333) pada populasi Tumbang Lahang. Nilai heterozigositas tertinggi diperoleh pada populasi Tumbang Lahang Lokus HEL013 yaitu sebesar ĥ=0,9667, sedangkan yang terendah terdapat pada populasi Buntut Bali Lokus ILSTS030 sebesar ĥ=0,1538. Rataan Heterozigositas (Ĥ) untuk lokus ILSTS073, ILSTS030 dan HEL013, masing-masing sebesar 0,5601, 0,2824 dan 0,9073. Kata-kata kunci : Sapi Katingan, DNA mikrosatelit, keragaman genetik i

3 ABSTRACT The Polymorphism of ILSTS073, ILSTS030, and HEL013 Microsatellite DNA Loci on Katingan Cattle in Central Kalimantan Muthmainnah, R., R. R. Noor, and Jakaria The aim of this research was to identify the polymorphisms of ILSTS070, ILSTS030 and HEL013 microsatellite DNA loci of Katingan cattle at Central Kalimantan. Blood samples were taken from 70 Katingan cattle which originated from three different populations, 13 blood samples were from Buntut Bali population, 26 blood samples were from Pendahara population and 31 blood samples were collected from Tumbang Lahang population. The amplification of microsatellite DNA marker was done by PCR (Polymerase Chain Reaction) and PCR product were then electrophoresed using 6% polyacrilamide gel followed by silver staining. The data were analyzed to get allele frequency, genotype frequency, heterozygosity value and genetic tree. The result showed that all microsatellite DNA loci were polymorphic. ILSTS073 locus had 13 alleles with the highest allele frequency was found in Pendahara population with allele E (0.5028) and the lowest allele frequency was found in Tumbang Lahang population with allele C and N (0.0167). ILSTS030 locus had 10 alleles with the highest allele frequency was found in Tumbang Lahang population with allele E (0.5167) and the lowest allele frequency was found in Tumbang Lahang population with allele C and N (0.0167). HEL013 locus had 12 alleles with the highest allele frequency was found in Buntut Bali population with allele F (0.4615) and the lowest allele frequency was found in Tumbang Lahang population with allele I and L (0.0167). The highest heterozygosity value was found in Tumbang Lahang population of HEL013 locus (ĥ=0.9667) and the lowest heterozygosity value was found in Buntut Bali population of ILSTS030 locus (ĥ=0.1538). The average heterozygosity (Ĥ) from ILSTS073, ILSTS030 and HEL013 locus were , and Keywords: Katingan cattle, microsatellite DNA, genetic diversity ii

4 KERAGAMAN DNA MIKROSATELIT LOKUS ILSTS073, ILSTS030 DAN HEL013 PADA SAPI KATINGAN DI KALIMANTAN TENGAH RAHMAH MUTHMAINNAH D Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011 iii

5 Judul Nama NIM : Keragaman DNA Mikrosatelit Lokus ILSTS073, ILSTS030 dan HEL013 pada Sapi Katingan di Kalimantan Tengah : Rahmah Muthmainnah : D Menyetujui, Pembimbing Utama, Pembimbing Anggota, (Prof. Dr. Ir. Ronny R. Noor, M.Rur.Sc.) NIP: (Dr. Jakaria, S.Pt. M.Si.) NIP: Mengetahui: Ketua Departemen, Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan (Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc.) NIP: Tanggal Ujian: 16 September 2011 Tanggal Lulus: iv

6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 21 Agustus 1989 di Cipinang, Jakarta Timur. Penulis adalah anak kedua dari delapan bersaudara dari pasangan Bapak Purboyanto D. N. dan Ibu Suryanti. Penulis mengawali pendidikan dasar pada tahun 1995 di SD Negeri 7 Prabumulih Barat, Sumatera Selatan. Pendidikan lanjutan tingkat pertama dimulai pada tahun 2001 diselesaikan pada tahun 2004 di SLTP N 2 Prabumulih Timur, Sumatera Selatan. Penulis melanjutkan di SMA N 1 Prabumulih Barat, Sumatera Selatan pada tahun 2004 dan diselesaikan pada tahun Penulis diterima di Institut Pertanian Bogor pada tahun 2007 melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) dan diterima di Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan (IPTP), Fakultas Peternakan Institut pada tahun Selama mengikuti pendidikan, penulis aktif di Lembaga Dakwah Kampus Al Hurriyyah IPB periode , Organisasi Mahasiswa Daerah Sumatera Selatan (IKAMUSI) IPB periode , dan Lembaga Dakwah Fakultas Peternakan (FAMM AL AN AAM) periode Penulis berkesempatan menjadi penerima beasiswa reguler KSE (Karya Salemba Empat) pada tahun 2010/2011. vii

7 KATA PENGANTAR Puji syukur senantiasa dipersembahkan kehadirat Allah SWT yang selalu memberikan rahmat dan hidayahnya kepada penulis sehingga penelitian dan penulisan skripsi ini dapat terselesaikan. Skripsi yang berjudul Identifikasi Keragaman DNA Mikrosatelit Lokus ILSTS073, ILSTS030 dan HEL013 pada Sapi Katingan di Kalimantan Tengah ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Sapi Katingan merupakan salah satu jenis sapi yang terdapat di Kalimantan Tengah. Sapi ini berpotensi untuk dikembangkan sebagai sapi potong. Sapi ini dipelihara oleh suku Dayak secara ekstensif di sepanjang sungai Katingan. Keberadaan sapi ini sudah puluhan tahun dan sudah beradaptasi dengan lingkungan. Peningkatan produktivitas dapat dilakukan dengan pemanfaatan beberapa teknologi, yaitu teknologi reproduksi dan teknologi DNA. Salah satu teknologi DNA yang digunakan untuk mengidentifikasi keragaman DNA adalah penciri DNA mikrosatelit. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman DNA mikrosatelit lokus ILSTS073, ILSTS030 dan HEL013 pada sapi Katingan di Kalimantan Tengah. Bogor, September 2011 Penulis viii

8 DAFTAR ISI RINGKASAN... ABSTRACT... LEMBAR PERNYATAAN... LEMBAR PENGESAHAN... RIWAYAT HIDUP... KATA PENGANTAR... DAFTAR ISI... DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... Halaman PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan... 2 TINJAUAN PUSTAKA... 3 Sapi Lokal Kalimantan Tengah... 3 Keragaman Genetik... 6 DNA Mikrosatelit... 6 METODE... 8 Lokasi dan waktu... 9 Materi... 9 Sampel Darah Sapi Katingan... 9 Ekstraksi DNA Amplifikasi DNA Polyacrilamide Gel Elektroforesis (PAGE) Silver Staining (Pewarnaan Perak) Alat-alat Prosedur Pengambilan Sampel Darah Sapi Katingan Isolasi dan Ekstraksi DNA Amplifikasi DNA Mikrosatelit Deteksi Alel DNA Mikrosatelit Analisis Data Frekuensi Alel Frekuensi Genotipe Derajat Heterozigositas i ii iii iv v vi vii ix x xi ix

9 Jarak Genetik dan Pohon Genetik HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi DNA Mikrosatelit Keragaman DNA Mikrosatelit Lokus ILSTS Lokus ILSTS Lokus HEL Nilai Heterozigositas Jarak Genetik KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran UCAPAN TERIMAKASIH DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN x

10 DAFTAR TABEL Nomor Halaman 1. Rataan dan Simpangan Baku Bobot Badan Sapi Katingan Informasi tentang Tiga Pasang Primer Pengapit DNA Mikrosatelit Macam Alel dan Genotipe serta Frekuensi Alel dan Genotipe Lokus ILSTS073 pada Populasi Sapi Katingan di Kalimantan Tengah Macam Alel dan Genotipe serta Frekuensi Alel dan Genotipe pada Lokus ILSTS073 pada Sapi Katingan di Kalimantan Tengah Macam Alel dan Genotipe serta Frekuensi Alel dan Genotipe Lokus ILSTS030 pada Populasi Sapi Katingan di Kalimantan Tengah Macam Alel dan Genotipe serta Frekuensi Alel dan Genotipe pada Lokus ILSTS030 pada Sapi Katingan di Kalimantan Tengah Macam Alel dan Genotipe serta Frekuensi Alel dan Genotipe Lokus HEL013 pada Populasi Sapi Katingan di Kalimantan Tengah Macam Alel dan Genotipe serta Frekuensi Alel dan Genotipe Lokus HEL013 pada Sapi Katingan di Kalimantan Tengah Nilai Heterozigositas sapi Katingan pada Ketiga Populasi Rataan Heterozigositas (Ĥ) dari Masing-masing Lokus Rataan Heterozigositas (Ĥ) pada Beberapa bangsa Sapi di Indonesia Jarak Genetik Sapi Katingan Populasi Pendahara, Buntut Bali, dan Pendahara Berdasarkan Metode UPGMA x

11 Nomor DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Keragaman Warna Bulu Sapi Katingan Betina Keragaman Warna Bulu Sapi Katingan Jantan Peta Lokasi Pengambilan Sampel Sapi Katingan Contoh Penentuan Genotipe Lokus ILSTS Distribusi Frekuensi Alel Lokus ILSTS Contoh Penentuan Genotipe Lokus ILSTS Distribusi Frekuensi Alel Lokus ILSTS Contoh Penentuan Genotipe Lokus HEL Distribusi Frekuensi Alel Lokus HEL Pohon Genetik Sapi Katingan Sub Populasi Pendahara, Buntut Bali, dan Pendahara Berdasarkan Metode UPGMA i

12 DAFTAR LAMPIRAN Nomor Halaman 1. Informasi Ulangan Nukleotida Lokus ILSTS073, ILSTS030 dan HEL Macam, Ukuran Alel dan Genotipe pada Lokus ILSTS073, Sapi Katingan, Kalimantan Tengah Macam, Ukuran Alel dan Genotipe pada Lokus ILSTS030, Sapi Katingan, Kalimantan Tengah Macam, Ukuran Alel dan Genotipe pada Lokus HEL013, Sapi Katingan, Kalimantan Tengah ii

13 PENDAHULUAN Latar Belakang Peternakan sapi potong merupakan salah satu komponen subsektor peternakan nasional yang mampu memberikan lahan usaha dan meningkatkan kesejahteraan sebagian masyarakat lokal setempat, memberikan perbaikan gizi melalui penyediaan protein hewani masyarakat luas. Sejumlah usaha telah dilakukan pemerintah untuk meningkatkan populasi dan produktivitas sapi potong domestik. Salah satu kebijakan pembangunan peternakan di Provinsi Kalimantan Tengah yang merupakan bagian integral dari kebijakan pembangunan nasional adalah upaya untuk kecukupan daging. Salah satu potensi ternak di Kalimantan Tengah adalah sapi lokal yang dipelihara di sepanjang daerah aliran sungai (DAS) Katingan secara ekstensif sehingga sapi tersebut oleh Dinas Peternakan Provinsi Kalimantan Tengah dikenal sebagai sapi Katingan. Sapi Katingan merupakan sapi lokal di Kalimantan Tengah yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai sapi potong. Keberadaan sapi Katingan telah lama dipelihara dan beradaptasi dengan lingkungan sekitarnya pada kondisi lahan yang tergolong asam pada ph berkisar antara 3-5 dan miskin mineral khususnya mineral Cu yang mungkin berpengaruh pada sapi Katingan. Sampai saat ini, informasi sapi Katingan masih terbatas, terutama dasar-dasar genetik, sehingga pemanfaatan potensi sapi Katingan sebagai ternak potong perlu dioptimalkan. Ilmu pengetahuan dan teknologi bidang molekuler yang semakin berkembang telah berhasil menemukan berbagai macam penanda molekuler khususnya marker berbasis DNA untuk mengetahui keragaman genetik (DNA) yang mungkin terkait dengan sifat-sifat ekonomis, kajian asal- usul atau kekerabatan dan studi genetika populasi. Salah satu teknologi DNA yang digunakan untuk mengetahui keragaman DNA adalah penciri DNA mikrosatelit. DNA mikrosatelit merupakan salah satu penanda molekuler yang sangat populer digunakan pada saat ini. DNA mikrosatelit merupakan salah satu penanda genetik yang efisien dibandingkan dengan penanda genetik yang lain, karena jumlahnya yang sangat besar dan menyebar hampir di seluruh genom (Georges et al., 1993). DNA mikrosatelit pada dasarnya adalah DNA bukan gen dan disebut juga sebagai short tandem repeats (STRs) yang merupakan 1

14 runutan DNA pendek berulang dengan panjang basa 1-5 nukleotida serta memiliki panjang total sekitar bp (Bennet, 2000). DNA mikrosatelit dapat dimanfaatkan untuk mendeteksi keragaman genetik baik dalam ataupun antara populasi. DNA mikrosatelit juga banyak digunakan sebagai penanda molekuler untuk mendukung pemuliaan ternak meliputi kegiatan dalam identifikasi ternak, penetapan asal-usul keturunan, penggalian sumber-sumber genetik, dan menjadi penanda molekuler penting dalam analisis genetik pada beberapa bangsa sapi (Ciampolini et al., 1995). Penelitian ini dilakukan karena data yang berhubungan dengan aspek genetik sapi Katingan belum pernah dilakukan. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman DNA mikrosatelit lokus ILSTS073, ILSTS030 dan HEL013 pada sapi Katingan di Kalimantan Tengah. 2

15 TINJAUAN PUSTAKA Sapi Lokal Kalimantan Tengah Berdasarkan aspek pewilayahan Kalimantan Tengah mempunyai potensi besar untuk pengembangan peternakan dilihat dari luas lahan km 2 yang terdiri atas lahan pasang surut (rawa) 5,5 juta ha dan lahan kering 7,7 juta ha, dengan ketersediaan pakan lokal yang melimpah. Luas lahan yang dapat dimanfaatkan untuk pengembangan peternakan seluas ha, belum termasuk daerah rawa. Kalimantan Tengah setiap tahun mendatangkan ternak sapi potong dari luar provinsi sekitar ekor karena produksi lokal hanya mampu memenuhi sekitar 45%-50% dari total kebutuhan, di sisi lain pemerintah secara nasional menargetkan swasembada daging sapi dicapai pada tahun Kondisi ini memerlukan berbagai upaya dan kerja keras semua pihak dan yang paling penting adalah bagaimana potensi sumberdaya lokal di daerah dapat dimanfaatkan secara optimal, baik sumberdaya genetik ternak maupun sumberdaya lahan dan pakan lokal (Adrial, 2010). Potensi pakan untuk wilayah Kalimantan Tengah sebenarnya tidak menjadi masalah. Potensi rumput alam mampu menampung pengembangan ternak 2,5 juta ekor sapi, disertai limbah pertanian tanaman pangan, sayuran, hortikultura dan perkebunan. Selain itu, Kalimantan Tengah juga memiliki sapi lokal yang oleh masyarakat setempat (suku Dayak) dinamakan sebagai sapi lokal. Sapi lokal Kalimantan Tengah belum memiliki nama, namun beberapa orang menyebut sesuai dengan nama Daerah Aliran Sungai (DAS) dimana sapi tersebut hidup (Adrial, 2010). Asal usul sapi lokal Kalimantan Tengah sampai saat ini masih belum diketahui secara pasti. Keberadaan sapi sudah puluhan tahun dan sudah beradaptasi dengan lingkungan sekitar yang lahannya tergolong asam dan miskin mineral. Sapi tersebut dapat dijumpai di Kabupaten Katingan dan Gunung Mas, diperkirakan juga terdapat di Kabupaten Seruyan. Dilaporkan populasi sapi lokal di Kabupaten Katingan sekitar ekor (Adrial, 2010). Sapi lokal Kalimantan Tengah memiliki potensi besar sebagai ternak potong, karena sapi ini mampu beradaptasi dengan lingkungan di Kalimantan Tengah yang asam dan miskin mineral, mempunyai produktivitas yang cukup baik pada kondisi 2

16 pemeliharaan ekstensif tradisional, relatif tahan terhadap berbagai macam penyakit dan parasit serta mempunyai kemampuan reproduksi yang tinggi. Potensi ini belum dapat dimanfaatkan secara optimal, bahkan banyak orang di Kalimantan Tengah yang tidak mengetahui bahwa Kalimantan Tengah mempunyai sapi lokal yang sangat potensial untuk dikembangkan (Adrial, 2010). Kabupaten Katingan merupakan salah satu Kabupaten yang terdapat di Kalimantan Tengah. Kabupaten Katingan memiliki sapi lokal yang diberi nama sapi Katingan oleh masyarakat setempat (suku Dayak) dimana sapi tersebut banyak ditemukan di sepanjang daerah aliran sungai Katingan. Data mengenai sapi Katingan baik dari pemerintah daerah Kalimantan Tengah maupun nasional belum ada, tetapi terdapat beberapa data mengenai keragaman morfometrik dan fenotipik sapi Katingan yang merupakan hasil penelitian Utomo et al. (2010), salah satunya yaitu keragaman warna bulu sapi Katingan sebagaimana disajikan pada Gambar 1 dan Gambar 2. Sumber : Utomo et al. (2010) Gambar 1. Keragaman Warna Bulu Sapi Katingan Betina 4

17 Sumber : Utomo et al. (2010) Gambar 2. Keragaman Warna Bulu Sapi Katingan Jantan Ciri umum sapi Katingan adalah bergelambir, berpunuk, bertanduk dan mempunyai banyak variasi warna bulu. Adapun penciri sapi Katingan ditunjukkan pada sapi betinanya. Ada enam variasi pertumbuhan tanduk pada sapi betina, namun yang dominan pertumbuhan tanduknya melengkung ke depan. Pertumbuhan tanduk pada sapi jantan umumnya ke samping atas. Ditemukan tonjolan diantara tanduk hanya pada sapi betina. Ada sembilan kombinasi warna pada sapi Katingan jenis kelamin betina yaitu warna coklat kemerahan, coklat keputihan, coklat warna sapi Bali, hitam, coklat keruh/kusam, coklat merah bata, kehitaman, putih kecoklatan dan putih keabuan. Sapi Katingan jenis kelamin jantan ditemukan delapan kombinasi warna yaitu coklat keputihan, coklat keputihan dan kemerahan, coklat kemerahan, kehitaman, coklat keputihan punuk hitam, coklat merah bata dan coklat merah bata punuk hitam (Utomo et. al., 2011). Hasil pengukuran bobot badan sapi Katingan di Kalimantan Tengah dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Rataan dan Simpangan Baku Bobot Badan Sapi Katingan Populasi Betina Jantan... Kg... Pendahara Buntut Bali Tumbang Lahang Sumber : Utomo et al. (2010) 5

18 Keragaman Genetik Keragaman genetik merupakan perbedaan antara individu dalam suatu populasi, antara individu dalam populasi yang berbeda dalam spesies yang sama atau dalam spesies yang berbeda (Hendrick, 2000). Keragaman genetik di dalam suatu populasi dapat dipengaruhi faktor-faktor yaitu seleksi, inbreeding, mutasi dan migrasi. Nei dan Kumar (2000) menyatakan bahwa variasi genetik terjadi jika terdapat dua alel atau lebih dalam suatu populasi (frekuensi lebih dari 1%). Keragaman genetik pada tingkat DNA dapat diketahui dengan melihat nilai frekuensi alel dan heterozigositas. Derajat heterozigositas merupakan rataan persentase lokus heterozigot pada setiap individu atau rataan persentase individu heterozigot di dalam populasi (Nei, 1987). Hartl dan Clark (2000) menyatakan bahwa polimorfisme genetik berguna untuk menentukan hubungan genetik dalam dan antara populasi yang terfragmentasi dalam suatu spesies. Menurut Li et al. (2000), keragaman genetik di antara subpopulasi dapat diketahui dengan cara melihat persamaan dan perbedaan frekuensi alel di antara subpopulasi tersebut. Beberapa teknik yang digunakan untuk melakukan analisis keanekaragaman genetik adalah Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Restricted Fragment Length Polymorphism (RFLP), Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) dan DNA Mikrosatelit. DNA Mikrosatelit DNA mikrosatelit adalah satu dari tipe DNA berulang yang paling umum digunakan sebagai penciri DNA dengan motif ulangan nukleotida sederhana dalam bentuk salinan berdampingan (tandem). DNA mikrosatelit merupakan salah satu penanda genetik yang efisien dibandingkan dengan penanda genetik yang lain, karena jumlahnya yang sangat besar dan menyebar hampir diseluruh genom (Georges et al., 1993). DNA mikrosatelit dapat memberikan penampakan polimorfisme atau proporsi gen atau alel yang berbeda pada masing-masing individu ternak (Ciampolini et al., 1995), sehingga akan memberikan kemudahan dalam analisis keragaman pada tingkat DNA. Penanda ini dapat dimanfaatkan dalam pemuliaan ternak terutama dalam mendeteksi keragaman genetik. Hoelzel (1998) menyatakan bahwa DNA mikrosatelit merupakan salah satu penciri genetik yang ideal untuk analisis genom karena jumlah cukup banyak di dalam genom. DNA 6

19 mikrosatelit memiliki tingkat ulangan nukleotida tiap lokus dan ditemukan pada sejumlah besar lokus spesifik dalam genom sehingga polimorfisme lokus tersebut dapat diketahui berdasarkan jumlah ulangan yang berbeda. DNA Mikrosatelit banyak digunakan sebagai penanda molekuler untuk mendukung pemuliaan ternak yang meliputi kegiatan dalam identifikasi ternak, penetapan asal-usul keturunan, penggalian sumber-sumber genetik dan menjadi penanda molekuler penting dalam analisis genetik pada beberapa sapi (Ciampolini et al., 1995). Selain itu, DNA mikrosatelit juga digunakan dalam pengenalan spesies antar mamalia, sidik jari DNA dan konservasi. Keragaman mikrosatelit ditunjukkan dengan variasi dalam jumlah pengulangan sekuen nukleotida. Tingkat keragaman mikrosatelit secara positif berhubungan dengan panjang dari sekuen berulang (Weber, 1990). Perbedaan alel yang dihasilkan disebabkan oleh perbedaan jumlah pengulangan basa (Bennett, 2000). Tipe dan kemurnian pengulangan merupakan bentuk dari keragaman mikrosatelit. Menurut Weber (1990) bahwa DNA mikrosatelit berdasarkan kemurnian pengulangan dibagi berdasarkan tiga kategori, yaitu: 1) mikrosatelit berulang sederhana (perfect repeats) yang terdiri dari sekuen tanpa tersisipi oleh penyela sepanjang unit berulangnya, 2) mikrosatelit berulang komplek (imperfect repeats) terdiri dari sekuen dengan satu atau lebih penyela dalam unit berulangnya, 3) mikrosatelit berulang campuran terdiri dari rangkaian perfect atau imperfect repeats berdampingan dengan sebuah rangkaian sekuen ulangan sederhana yang lain. Keragaman mikrosatelit ini berkaitan dengan ketidakstabilan lokus. Keragaman yang tinggi dari lokus mikrosatelit dihasilkan dari kecepatan mutasi yang tinggi yaitu berkisar /lokus/generasi (Lehmann et al., 1996). Ketidakstabilan dan keragaman DNA mikrosatelit diduga disebabkan rekombinasi yang tidak seimbang dan DNA polimerase slippage (Maskur, 2001). Keragaman dalam DNA mikrosatelit dapat dideteksi dengan menggunakan teknologi PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan bantuan sekuen pengapit yang khas (primer) yang digunakan untuk mengamplifikasi fragmen target (lokus DNA mikrosatelit). Primer bersifat spesifik sehingga primer tersebut hanya mampu mengamplifikasi lokus tertentu. Fragmen DNA mikrosatelit yang diamplifikasi dapat divisualisasikan dengan melakukan proses elektroforesis yang dilanjutkan dengan proses pewarnaan perak (silver 5 7

20 staining). Penggunaan marka mikrosatelit sebelumnya juga sudah digunakan untuk meneliti sapi lokal Indonesia lainnya yaitu sapi Bali pada lokus INRA035 yang menemukan dua alel yaitu alel A dan B dan lokus HEL9 yang menemukan satu alel yaitu alel A (Noor et al., 2000). 8

21 METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Genetika dan Molekuler Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dimulai dari Desember 2010 sampai dengan Mei Materi Sampel Darah Sapi Katingan Sampel darah yang digunakan berasal dari populasi sapi Katingan di Kalimantan Tengah sebanyak 70 sampel darah dari populasi Pendahara sebanyak 26 ekor, Buntut Bali 13 ekor, dan Tumbang Lahang 31 ekor. Sapi tersebut diperoleh dari beberapa peternak yang terdiri atas sapi jantan dan sapi betina. Lokasi pengambilan sampel sapi Katingan dapat dilihat pada Gambar 3. Sumber: Bhermana (2010) Gambar 3. Peta Lokasi Pengambilan Sampel Sapi Katingan 2

22 Ekstraksi DNA Bahan-bahan yang digunakan dalam ekstraksi DNA adalah sampel darah, SDS (sodium dosesil sulfat), proteinase-k, STE (Sodium Tris-EDTA), CIAA (Chloroform Iso Amil Alkohol), larutan phenol, ethanol absolut, NaCl, TE (Tris EDTA) dan DW (destilated water). Amplifikasi DNA Bahan-bahan yang digunakan dalam amplifikasi DNA yaitu DW (destilated water), primer, dntps, MgCl 2, dream taq buffer dan Taq Polimerase. Polyacrilamide Gel Elektrophoresis (PAGE) Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan PAGE yaitu larutan akrilamid, TEMED (N,N,N,N -tetramethylethylenediamine), DW (destilated water), APS (ammonium peroxodisulfat) 10%, dan larutan 5x TBE (tris boric acid-edta). Silver Staining (Pewarnaan Perak) Bahan-bahan yang digunakan untuk silver staining (pewarnaan perak), yaitu DW (destilated water), AgNO 3, NaOH, formaldehida, asam asetat, dan amonia. Alat-alat Alat yang digunakan adalah mesin PCR, tabung eppendorf (0,2 µl dan 1,5 µl), pipet mikro, tip, vortex, centrifuge, inkubator, disposible syringe 10 ml, tube test 12 ml, kertas label, tabung 1,5 ml, freezer, desikator, spiser, penjepit, karet, sisir, mesin elektroforesis serta nampan. Prosedur Pengambilan Sampel Darah Sapi Katingan Sampel darah sapi Katingan diperoleh dari koleksi Laboratorium Genetika dan Molekuler Ternak pada tahun 2010 yang dimasukkan dalam ethanol absolut dan disimpan pada suhu ruang. Isolasi dan Ekstraksi DNA Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode Sambrook et al. (1989) yang dimodifikasi. Sebanyak 200 µl sampel darah dalam etanol absolut dipindahkan 10

23 ke tabung 1,5 µl kemudian ditambahkan µl DW/TE. Larutan dikocok kuat atau dengan menggunakan vortex dan didiamkan ± lima menit, disentrifugasi pada kecepatan rpm selama ± lima menit, bagian supernatan dibuang dan kemudian diulangi lagi tahapan tersebut, setelah itu ditambahkan SDS 10% sebanyak 40 µl, proteinase-k lima mg/ml sebanyak 10 µl, dan 1 x STE sampai 400 µl. Larutan dikocok dalam inkubator pada suhu 55 ºC selama dua jam, kemudian ditambahkan larutan phenol sebanyak 400 µl, kloroform isoamil alkohol (CIAA) sebanyak 400 µl, dan DNA diendapkan dengan 5 M NaCl sebanyak 40 µl. Larutan dikocok pelan pada suhu ruang selama 1 jam, kemudian disentrifugasi pada kecepatan rpm selama lima menit. Bagian DNA (bening) dipindahkan dengan menggunakan pipet ke tabung 1.5 µ baru sebanyak 400 µl, kemudian ditambahkan EtOH absolut sebanyak 800 µl dan 5 M NaCl sebanyak 40 µl. Larutan disimpan di freezer selama satu malam. Endapan dicuci dengan menambahkan 70 % etanol sebanyak 400 μl, disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama lima menit, etanol dibuang dan diuapkan dengan menggunakan pompa vakum, selanjutnya DNA dilarutkan dengan 80% buffer TE sebanyak 80 μl. Amplifikasi DNA Mikrosatelit Primer yang digunakan untuk menganalisis keragaman DNA mikrosatelit sapi Katingan adalah ILSTS073, ILSTS030, dan HEL013 (Tabel 2). Reaksi PCR yang digunakan terdiri dari DNA 1 µl, primer 0,05 µl, dntp 0,1 µl, MgCl 2 0,25 µl, 10 x buffer 1,25 µl, DW (destilated water) 9,3 µl, dan tag DNA Polimerase 0,05 µl. Kondisi PCR kemudian dijalankan sebagai berikut : siklus pertama adalah denaturasi awal pada 94 ºC selama lima menit, diikuti dengan 35 siklus yang masingmasing terdiri dari denaturasi (94 ºC selama 20 detik), penempelan primer (55-60 ºC), pemanjangan (72 ºC selama 45 detik), dan diakhiri dengan satu siklus berikutnya yaitu pemanjangan akhir pada 72 ºC selama lima menit. Deteksi Alel DNA Mikrosatelit Pengujian produk PCR dilakukan dengan menggunakan metode elektroforesis gel poliakrilamid (6%) dan dilanjutkan dengan pewarnaan perak (silver staining). Prosedur elektroforesis dilakukan dengan menggunakan metode Sambrook et al. (1989). Polyacrilamida Gel Electrophoresis (PAGE) yang digunakan yaitu 11

24 PAGE 6%. Elektroforesis akrilamid dijalankan pada voltase 100 volt selama ± 1,5 jam. Setiap sumur pada gel diisi dengan produk PCR sebanyak 2 µl yang dicampur dengan 0,25 µl larutan pemberat (loading dye). Satu sumur gel terakhir diisi dengan DNA marker 20 bp sebanyak 1 µl sebagai ukuran standar pita-pita DNA hasil amplifikasi. Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan metode pewarnaan perak (silver staining) menurut Tegelstrom (1992). Pewarnaan perak terdiri atas empat tahap yaitu perendaman dengan larutan A (DW 200 ml, AgNO 3 0,2 gram, 10 N NaOH sebanyak 80 ml, dan ammonia 800 µl), DW sebanyak 200 ml, larutan B (DW 200 ml, NaOH sebanyak 6 gram, formaldehid 200 µl) dan terakhir larutan C (DW 100 µl dan 100 µl asetat). Gel kemudian dimasukkan ke dalam larutan A sambil digoyang-goyang selama ± delapan menit, kemudian gel dicuci dengan DW (destilated water) selama dua menit. Selanjutnya gel direndam dalam larutan B sampai muncul pita. Larutan B sebelum digunakan dipanaskan terlebih dahulu di dalam waterbath pada suhu ºC sampai siap digunakan. Setelah pita muncul, kemudian gel dicuci dengan asam asetat glasial. Setelah selesai dicuci dengan larutan C, kemudian gel diletakkan di dalam plastik dan disimpan. Tabel 2. Informasi tentang Tiga Pasang Primer Pengapit DNA Mikrosatelit Kromosom Lokus TA ( C) Runutan Primer (5 3 ) Motif Ulangan 19 ILSTS F:AGGGCAGGAGTAATCTTTGG (CA) 20 R:AACAGAGAGTATGGTGGTGG 2 ILSTS F:CTGCAGTTCTGCATATGTGG (GT) 10 R:CTTAGACAACAGGGGTTTGG 11 HEL F:TAAGGACTTGAGATAAGGAG (CA) 18 R: CCATCTACCTCCATCTTAAC Sumber: Kathiravan et al. (2009) Keterangan : TA = Temperature Annealing 12

25 Analisis Data Frekuensi Alel Frekuensi alel untuk setiap lokus DNA mikrosatelit dihitung menggunakan rumus Nei (1987): Keterangan : j 1 xi = frekuensi alel ke-i n ij = jumlah individu untuk genotip ij n ii = jumlah individu untuk genotip ii N = jumlah alel Frekuensi Genotipe Frekuensi Genotipe ditentukan dengan menggunakan rumus Nei dan Kumar (2000): Keterangan : x i n i N = frekuensi genotipe ke-i = jumlah individu bergenotipe ke-i = jumlah individu Derajat Heterozigositas Derajat heterozigositas ditentukan dengan menggunakan rumus Nei dan Kumar (2000): 13

26 Keterangan : h x i n = nilai heterozigositas = frekuensi alel ke-i = jumlah individu Rataan heterozigositas pada setiap lokus dihitung dengan menggunakan rumus Nei dan Kumar (2000): Ĥ Keterangan : Ĥ = rataan heterozigositas semua lokus ĥ j r = heterozigositas lokus ke-j = jumlah lokus Jarak Genetik dan Pohon Genetik Jarak dan pohon genetik dibuat dengan menggunakan perangkat lunak POPGENE Versi 32. Metode yang digunakan adalah metode UPGMA (Unweighted Pair-Group Methode with Arithmetic Mean) (Nei, 1987). 14

27 HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi DNA Mikrosatelit Amplifikasi DNA mikrosatelit pada sapi Katingan dianalisis menggunakan tiga primer yaitu ILSTS073, ILSTS030 dan HEL013. Ketiga primer tersebut dapat mengamplifikasi dengan baik sampel DNA, namun dari total 70 sampel yang digunakan ditemukan beberapa sampel yang tidak dapat diamplifikasi oleh primer tersebut. Suhu annealing berhasil didapat setelah dilakukan optimasi, diperoleh suhu annealing untuk lokus ILSTS073 adalah 55 o C, lokus ILSTS o C dan lokus HEL o C. Suhu annealing pada lokus ILSTS030 berbeda dengan yang digunakan oleh Kathiravan et al. (2009). Perbedaan suhu ini mungkin disebabkan jenis ternak yang digunakan. Lokus ILSTS073, lokus ILSTS030 dan HEL013 masing-masing dapat mengamplifikasi 67, 68 dan 65 sampel sapi Katingan. Pita target dapat dilihat setelah dilakukan proses silver staining pada gel akrilamid. Perbedaan panjang dari pita target menunjukkan perbedaan alel. Selain pita target, muncul juga pita-pita tambahan seperti yang dapat dilihat pada gambar gel akrilamid. Menurut Poerwanto (1993), konsentrasi enzim yang terlalu tinggi dan jumlah siklus yang berlebih juga dapat menjadi penyebab munculnya pita-pita tambahan. Sampel yang tidak dapat diamplifikasi pada lokus ILSTS073, lokus ILSTS030 dan HEL013 masing-masing sejumlah 3, 2 dan 5 sampel. Hal ini mungkin dikarenakan primer tidak dapat menempel pada daerah komplemennya sehingga DNA mikrosatelit yang diapit tidak dapat diamplifikasi atau dikarenakan pencampuran bahan PCR tidak sempurna. Menurut Poerwanto (1993), faktor-faktor yang mempengaruhi hasil PCR adalah konsentrasi enzim (taq polimerase), dntp (deoxynucleotide triphosphate), konsentrasi magnesium (MgCl 2 ), suhu, jumlah siklus, konsentrasi primer dan DNA templet. Konsentrasi enzim yang terlalu tinggi dan jumlah siklus yang berlebihan akan menyebabkan latar yang tidak spesifik. Kondisi suhu penempelan primer (annealing) juga sangat menentukan baik tidaknya proses amplifikasi. 2

28 Keragaman DNA Mikrosatelit Keragaman genetik merupakan perbedaan antara individu dalam suatu populasi, antara individu dalam populasi yang berbeda dalam spesies yang sama atau dalam spesies yang berbeda (Hendrick, 2000). Hasil analisis DNA mikrosatelit lokus ILSTS073, lokus ILSTS030 dan HEL013 masing-masing menghasilkan 13 alel, 10 alel dan 12 alel. Berikut ini disajikan keragaman DNA mikrosatelit setiap lokus pada sapi Katingan. Lokus ILSTS073 Lokus ILSTS073 menghasilkan 13 alel dengan macam alel yaitu alel A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, M dan N. Ukuran alel terendah sebesar 148 pb dan ukuran alel tertinggi yaitu 184 pb. Kesemua alel tersebut diberi tanda abjad sesuai dengan ukuran alelnya. Contoh penentuan genotipe dari pewarnaan perak sampel pada lokus ILSTS073 dapat dilihat pada Gambar pb Keterangan : M = marker (*) = tidak dilakukan genotyping (bukan sapi Katingan) (1a-8)= nomor sampel Gambar 4. Contoh Penentuan Genotipe Lokus ILSTS073 Macam alel yang dihasilkan berbeda antara populasi Buntut Bali, populasi Pendahara, dan populasi Tumbang Lahang. Informasi mengenai macam alel, frekuensi alel, genotipe, dan frekuensi genotipe untuk masing-masing populasi pada lokus ILSTS073 dapat dilihat pada Tabel 3. 16

29 Tabel 3. Macam Alel dan Genotipe serta Frekuensi Alel dan Genotipe Lokus ILSTS073 pada Populasi Sapi Katingan di Kalimantan Tengah Populasi Jumlah Alel Alel dan Ukuran (pb) Frekuensi Alel Genotipe Frekuensi Genotipe Buntut Bali 7 C (156) 0,1154 DD 0,0769 (n=13) D (158) 0,1154 EE 0,3076 E (160) 0,4231 CG 0,2308 G (162) 0,1154 EH 0,0769 H (166) 0,0385 EI 0,1538 I (168) 0,1538 II 0,0769 M (178) 0,0385 DM 0,0769 Pendahara 10 A (148) 0,0208 AB 0,0417 (n=24) B (152) 0,0208 DD 0,0417 D (158) 0,0833 DE 0,0417 E (160) 0,5208 EE 0,3333 G (162) 0,1667 DG 0,0417 H (166) 0,0208 EG 0,0417 I (168) 0,0833 GG 0,0833 J (170) 0,0417 EH 0,0417 K (174) 0,0208 EI 0,1667 N (180) 0,0208 EJ 0,0833 GK 0,0417 GN 0,0417 Tumbang 8 C (156) 0,0167 CD 0,0333 Lahang (n=30) D (158) 0,1167 DD 0,0333 E (160) 0,5167 DE 0,0333 F (162) 0,0833 EE 0,3333 H (166) 0,1333 DF 0,1000 I (168) 0,0833 EH 0,1333 K (174) 0,0333 FH 0,0333 N (180) 0,0167 HH 0,0333 EI 0,1667 EK 0,0333 FK 0,0333 HN 0,0333 Hasil tersebut menunjukkan bahwa pada lokus ILSTS073, populasi Buntut Bali, Pendahara dan Tumbang Lahang masing-masing menghasilkan 7, 10 dan 8 alel. Frekuensi alel tertinggi pada lokus ILSTS073 adalah alel E pada populasi Pendahara sebesar 0,5208 dan alel yang rendah adalah alel C dan N pada populasi Tumbang Lahang yaitu masing-masingsebesar 0,0167. Frekuensi genotipe tertinggi pada ketiga populasi yaitu genotipe EE dengan nilai frekuensi genotipe untuk populasi Buntut Bali, Pendahara, dan Tumbang Lahang berturut-turut 0,3076, 0,3333 dan 0,

30 Frekuensi genotipe yang rendah untuk populasi Buntut Bali yaitu genotipe DD, EH, II, dan DM dengan nilai frekuensi genotipe 0,0769, frekuensi genotipe yang rendah pada populasi Pendahara yaitu genotipe AB, DD, DE, DG, EG, EH, GK, dan GN dengan nilai frekuensi genotipe 0,0417, sedangkan untuk frekuensi genotipe yang rendah pada populasi Tumbang Lahang yaitu genotipe CD, DD, DE, EE, FH, HH, EK, FK, HN dengan nilai frekuensi genotipe 0,0333. Distribusi frekuensi alel pada lokus ILSTS073 dari masing-masing populasi disajikan pada Gambar (%) Buntut Bali Pendahara Tumbang Lahang 10 0 Macam Alel Gambar 5. Distribusi Frekuensi Alel Lokus ILSTS073 Hasil distribusi alel pada Gambar 5 menunjukkan bahwa beberapa alel yang hanya muncul pada populasi tertentu. Beberapa alel yang ditemukan pada populasi Pendahara dan Tumbang Lahang tidak ditemukan pada populasi Buntut Bali pada Lokus ILSTS073, seperti alel M yang hanya ditemukan pada populasi Buntut Bali serta alel C yang hanya terdapat pada populasi Buntut Bali dan Tumbang Lahang. Informasi mengenai frekuensi masing-masing alel dan genotipe untuk lokus ILSTS073 disajikan pada Tabel 4. 18

31 Tabel 4. Macam Alel dan Genotipe serta Frekuensi Alel dan Genotipe pada Lokus ILSTS073 pada Sapi Katingan di Kalimantan Tengah Macam Alel Frekuensi Alel Macam Genotipe Frekuensi Genotipe A 0,0075 DD 0,0448 B 0,0075 EE 0,3284 C 0,0296 CG 0,0448 D 0,1045 EH 0,0896 E 0,5000 DM 0,0149 F 0,0373 AB 0,0149 G 0,0821 DE 0,0299 H 0,0746 DG 0,0149 I 0,0970 EG 0,0149 J 0,0149 GG 0,0299 K 0,0224 EJ 0,0149 M 0,0075 GK 0,0149 N 0,0149 GN 0,0149 EI 0,1642 II 0,0149 CD 0,0149 DF 0,0149 FH 0,0149 HH 0,0149 EK 0,0149 FK 0,0149 HN 0,0149 Berdasarkan Tabel 4 di atas, hasil tersebut menunjukkan bahwa alel E merupakan alel tertinggi, alel E ini mendominasi alel lain yang berarti bahwa kemungkinan tetua dari sapi Katingan memiliki alel dominan E, seperti yang dinyatakan oleh Ciampolini et al. (1995) bahwa DNA Mikrosatelit banyak digunakan sebagai penanda molekuler untuk mendukung pemuliaan ternak meliputi kegiatan dalam identifikasi ternak, penetapan asal-usul keturunan, penggalian sumber-sumber genetik, dan menjadi penanda molekuler penting dalam analisis genetik pada beberapa sapi. Nei dan Kumar (2000) menyatakan bahwa variasi genetik terjadi jika terdapat dua alel atau lebih dalam satu populasi (frekuensi alel lebih dari 1%). Perbedaan jumlah alel yang diperoleh disebabkan bangsa sapi yang digunakan (Bishop et al., 1994) dan perbedaan jumlah sampel yang digunakan (Winaya, 2000). Prahasta (2001) menyatakan bahwa semakin banyak jumlah sampel yang digunakan maka akan semakin banyak kemungkinan alel yang muncul. Moxon dan Will (1999) 19

32 menyatakan bahwa keragaman mikrosatelit tersebut disebutkan perbedaan ukuran DNA mikrosatelit pada masing-masing lokus, sebagai hasil rekombinasi tidak seimbang saat replikasi DNA yang berakibat pada penarikan dan pengurangan jumlah nukleotida. Jumlah alel yang muncul tidak hanya dipengaruhi jumlah sampel yang digunakan, tetapi juga dipengaruhi oleh bangsa sapi dan sistem perkawinan yang dilakukan (Fikri, 2002). Menurut Utomo et. al. (2011), perkawinan pada sapi Katingan terjadi secara alam karena pejantan kebanyakan tersedia dalam kelompok sapi-sapi tersebut. Lokus ILSTS030 Lokus ILSTS030 menghasilkan sebanyak 10 alel dengan macam alel yaitu alel A, B, C, D, E, F, G, H, I dan J. Ukuran alel terendah sebesar 140 pb dan ukuran alel tertinggi yaitu 178 pb. Kesemua alel tersebut diberi tanda abjad A hingga J sesuai dengan ukuran alelnya. Hasil sebagian genotipe dari pewarnaan perak sampel pada lokus ILSTS030 dapat dilihat pada Gambar pb Keterangan : M = marker (*) = tidak dilakukan genotyping (bukan sapi Katingan) (21, 46-55)= nomor sampel Gambar 6. Contoh Penentuan Genotipe Lokus ILSTS030 Informasi mengenai macam alel, frekuensi alel, genotipe, dan frekuensi genotipe pada masing-masing populasi pada lokus ILSTS030 dapat dilihat pada Tabel 5. Jumlah alel yang dihasilkan pada lokus ILSTS030 pada populasi Buntut Bali, Pendahara, dan Tumbang Lahang masing-masing sebanyak 6, 8 dan 8 alel. Frekuensi alel tertinggi pada lokus ILSTS030 adalah alel G pada populasi Tumbang 20

33 Lahang sebesar 0,4000 dan alel terendah adalah alel J pada populasi Tumbang Lahang yaitu sebesar 0,0167. Tabel 5. Macam Alel dan Genotipe serta Frekuensi Alel dan Genotipe Lokus ILSTS030 pada Populasi Sapi Katingan di Kalimantan Tengah Populasi Jumlah Alel Alel dan Ukuran (pb) Frekuensi Alel Genotipe Frekuensi Genotipe Buntut Bali 6 B (146) 0,1154 BB 0,0769 (n=13) D (150) 0,1538 DD 0,1538 E (152) 0,1538 EE 0,1538 F (154) 0,0769 FF 0,0769 G (156) 0,3077 BG 0,0769 I (160) 0,1923 GG 0,2308 GI 0,0769 II 0,1538 Pendahara 8 B (146) 0,1000 BD 0,0400 (n=25) C (148) 0,0200 DD 0,1200 D (150) 0,1400 BE 0,0400 E (152) 0,2600 CE 0,0400 F (154) 0,0800 EE 0,2000 G (156) 0,2400 FF 0,0800 H (158) 0,0600 BG 0,0800 I (160) 0,1000 GG 0,1600 EH 0,0400 HH 0,0400 BI 0,0400 GI 0,0800 II 0,0400 Tumbang 8 A (140) 0,0333 AB 0,0333 Lahang (n=30) B (146) 0,0833 CC 0,0333 C (148) 0,0333 BD 0,0333 D (150) 0,1333 DD 0,1000 E (152) 0,1000 EE 0,1000 F (154) 0,0833 BF 0,0333 G (156) 0,4000 FF 0,0667 H (158) 0,0667 AG 0,0333 I (160) 0,0500 BG 0,0667 J (178) 0,0167 DG 0,0333 GG 0,3000 HH GI IJ

34 Frekuensi genotipe yang tinggi dari populasi Buntut Bali, Pendahara, dan Tumbang Lahang berturut-turut yaitu GG, EE dan GG dengan nilai frekuensi genotipe 0,2308, 0,2000, dan 0,3000. Frekuensi genotipe yang rendah untuk populasi Buntut Bali yaitu genotipe BB, FF, BG dan GI dengan nilai frekuensi genotipe 0,0769, frekuensi genotipe yang rendah pada populasi Pendahara yaitu genotipe BD, BE, CE, EH, HH, BI dan II dengan nilai frekuensi genotipe 0,0400, sedangkan untuk frekuensi genotipe yang rendah pada populasi Tumbang Lahang yaitu genotipe AB, CC, BD, BF, AG, DG dan IJ dengan nilai frekuensi genotipe 0,0333. Distribusi frekuensi alel pada lokus ILSTS030, disajikan pada Gambar (%) Macam Alel Gambar 7. Distribusi Frekuensi Alel Lokus ILSTS030 Hasil distribusi alel pada Gambar menunjukkan bahwa beberapa alel yang hanya muncul pada populasi tertentu. Beberapa alel yang ditemukan pada populasi Tumbang Lahang tidak ditemukan pada populasi Buntut Bali dan Pendahara pada Lokus ILSTS030, seperti alel A dan J yang hanya ditemukan pada populasi Tumbang Lahang. Informasi mengenai frekuensi masing-masing alel dan genotipe untuk lokus ILSTS030 disajikan pada Tabel 6. 22

35 Tabel 6. Macam Alel dan Genotipe serta Frekuensi Alel dan Genotipe pada Lokus ILSTS030 pada Sapi Katingan di Kalimantan Tengah Macam Alel Frekuensi Alel Macam Genotipe Frekuensi Genotipe A 0,0147 DD 0,1176 B 0,0956 EE 0,1470 C 0,0221 AG 0,0147 D 0,0140 BI 0,0147 E 0,1691 AB 0,0147 F 0,0809 CC 0,0147 G 0,3162 DG 0,0147 H 0,0518 BG 0,0735 I 0,0809 GG 0,2352 J 0,0007 IJ 0,0147 BD 0,0294 EH 0,0147 II 0,0441 BE 0,0147 BF 0,0147 HH 0,0441 BB 0,0147 FF 0,0735 GI 0,0735 CE 0,0147 Hasil tersebut menunjukkan bahwa alel G merupakan alel tertinggi. Alel G ini mendominasi alel lainnya yang berarti bahwa kemungkinan salah satu tetua dari sapi Katingan yang beralel G ditemukan banyak pada sapi Katingan. Lokus HEL013 Lokus HEL013 menghasilkan sebanyak 12 alel dengan macam alel yaitu alel B, C, D, E, F, G, H, I, M, N, O dan P. Ukuran alel terendah sebesar 174 pb dan ukuran alel tertinggi yaitu 204 pb. Kesemua alel tersebut diberi tanda abjad sesuai dengan ukuran alelnya berturut-turut (174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 196, 200, 202, dan 204 pb). Contoh penentuan genotipe dari pewarnaan perak sampel pada lokus HEL013 dapat dilihat pada Gambar 8. 23

36 140 pb Keterangan : M = marker (*) = tidak dilakukan genotyping (bukan sapi Katingan), (45-56)= nomor sampel Gambar 8. Contoh Penentuan Genotipe Lokus HEL013 Informasi mengenai macam alel, frekuensi alel, genotipe, dan frekuensi genotipe untuk masing-masing populasi pada lokus HEL013 dapat dilihat pada Tabel 7. Jumlah alel yang dihasilkan pada lokus HEL013 pada populasi Buntut Bali, Pendahara, dan Tumbang Lahang masing-masing sebanyak 5, 10 dan 8 alel. Frekuensi alel tertinggi pada lokus HEL013 adalah alel F pada populasi Buntut Bali sebesar 0,4615 dan alel yang rendah adalah alel I dan L pada populasi Tumbang Lahang yaitu sebesar 0,0167. Frekuensi genotipe tertinggi dari populasi Buntut Bali, Pendahara, dan Tumbang Lahang yaitu genotipe FN dengan nilai frekuensi genotipe 0,6923, 0,5909, dan 0,7000. Frekuensi genotipe yang rendah untuk populasi Buntut Bali yaitu genotipe DF, FF, GG dan GO dengan nilai frekuensi genotipe 0,0769, frekuensi genotipe yang rendah pada populasi Pendahara yaitu genotipe BB, CF, FF, EG, FH, GI dan EL dengan nilai frekuensi genotipe 0,0455, sedangkan untuk frekuensi genotipe yang rendah pada populasi Tumbang Lahang yaitu genotipe EE, GI, EL dan GN dengan nilai frekuensi genotipe 0,

37 Tabel 7. Macam Alel dan Genotipe serta Frekuensi Alel dan Genotipe Lokus HEL013 pada Populasi Sapi Katingan di Kalimantan Tengah Populasi Jumlah Alel Alel dan Ukuran (pb) Frekuensi Alel Genotipe Frekuensi Genotipe Buntut Bali 5 D (178) 0,0385 DF 0,0769 (n=13) F (182) 0,4615 FF 0,0769 G (184) 0,1154 GG 0,0769 N (200) 0,3462 FN 0,6923 O (202) 0,0385 GO 0,0769 Pendahara 10 B (174) 0,0455 BB 0,0455 (n=22) C (176) 0,0227 CF 0,0455 E (180) 0,0455 FF 0,0455 F (182) 0,3864 EG 0,0455 G (184) 0,0909 FH 0,0455 H (186) 0,0227 GI 0,0455 I (188) 0,0227 EL 0,0455 L (196) 0,0227 FN 0,5909 N (200) 0,2955 GO 0,0909 O (202) 0,0455 Tumbang 8 E (180) 0,0500 EE 0,0333 Lahang (n=30) F (182) 0,3500 GI 0,0333 G (184) 0,0833 EL 0,0333 H (186) 0,0333 FN 0,7000 I (188) 0,0167 GN 0,0333 L (196) 0,0167 GO 0,1000 N (200) 0,0500 HP 0,6667 P (204) 0,0333 Distribusi frekuensi alel lokus HEL013, disajikan pada Gambar (%) Macam Alel Gambar 9. Distribusi Frekuensi Alel Lokus HEL013 25

38 Hasil distribusi alel pada Gambar 8 menunjukkan bahwa beberapa alel hanya muncul pada populasi tertentu. Beberapa alel yang ditemukan pada populasi Tumbang Lahang ada yang tidak ditemukan pada populasi Buntut Bali dan Pendahara pada lokus HEL013, seperti alel P yang hanya ditemukan pada populasi Tumbang Lahang serta alel D yang hanya ditemukan pada populasi Buntut Bali. Informasi mengenai frekuensi masing-masing alel dan genotipe untuk lokus ILSTS030 disajikan pada Tabel 8. Tabel 8. Macam Alel dan Genotipe serta Frekuensi Alel dan Genotipe pada Lokus HEL013 pada Sapi Katingan di Kalimantan Tengah Macam Alel Frekuensi Alel Macam Genotipe Frekuensi Genotipe B 0,0154 FN 0,6769 C 0,0077 EG 0,0154 D 0,0077 CF 0,0154 E 0,0385 HP 0,0154 F 0,3846 GG 0,0154 G 0,0923 FF 0,0376 H 0,0231 GI 0,0154 I 0,0154 FH 0,0154 L 0,0154 EE 0,0154 N 0,3385 DF 0,0154 O 0,0462 GO 0,0923 P 0,0154 EL 0,0376 BB 0,0154 GN 0,0154 Berdasarkan Tabel 8 di atas, hasil tersebut menunjukkan bahwa alel F dan alel N merupakan alel tertinggi, kedua alel ini mendominasi alel lainnya yang berarti bahwa kemungkinan salah satu tetua dari sapi Katingan yang beralel F atau beralel N ditemukan banyak pada sapi Katingan. Nilai Heterozigositas Nilai heterozigositas (ĥ) tertinggi ditemukan pada populasi Tumbang Lahang yaitu pada lokus HEL013 (0,9667) dan terendah (0,1538) ditemukan pada populasi Buntut Bali yaitu pada lokus ILSTS030. Rataan Heterozigositas (Ĥ) dari ketiga lokus menunjukkan bahwa sapi Katingan yang berasal dari populasi Tumbang Lahang mempunyai keragaman genetik yang sedikit lebih tinggi (0,6333) dibandingkan sapi Katingan yang berasal dari populasi Buntut Bali (0,5128) dan Pendahara (0,6063). 26

39 Prahasta (2001) menyatakan bahwa semakin banyak sampel yang digunakan pada suatu lokus maka semakin besar nilai heterozigositas yang diperoleh, Nilai heterozigositas dari ketiga primer yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 9. Tabel 9. Nilai Heterozigositas sapi Katingan pada Ketiga Populasi Lokus (ĥ) pada Populasi Buntut Bali Pendahara Tumbang Lahang ILSTS073 0,5385 0,5417 0,6000 ILSTS030 0,1538 0,3600 0,3333 HEL013 0,8462 0,9091 0,9667 Rataan Heterozigositas (Ĥ) 0,5128 0,6036 0,6333 Nei (1987) menyatakan bahwa nilai heterozigositas (ĥ) merupakan cara paling akurat untuk mengukur variasi genetik. Menurut Takezaki dan Nei (1996), untuk mengukur keragaman genetik, rataan heterozigositas dari lokus-lokus mikrosatelit antara 0,3 dan 0,8 dalam populasi, dengan demikian sudah sesuai dengan kategori tersebut. Tingkat heterozigositas dapat dipengaruhi oleh ukuran atau jumlah populasi (Nei, 1987). Derajat heterozigositas dapat diperoleh dari rataan persentase lokus heterozigot tiap individu atau rataan persentase individu heterozigot di dalam populasi (Nei dan Kumar, 2000). Keragaman genetik pada tingkat DNA dapat diketahui dengan melihat nilai heterozigositas dan frekuensi alel. Rataan Heterozigositas (Ĥ) dari masing-masing lokus dapat dilihat pada Tabel 10. Tabel 10. Rataan Heterozigositas (Ĥ) dari Masing-masing Lokus No. Lokus Rataan Heterozigositas (Ĥ) 1 ILSTS073 0, ILSTS030 0, HEL013 0,9231 Berdasarkan Tabel di atas dapat dilihat bahwa raatan heterozigositas (Ĥ) tertinggi terdapat pada lokus HEL013 dan terendah terdapat pada lokus ILSTS

40 Rataan heterozigositas (Ĥ) dari heterozigositas yang tinggi pada subpopulasi/populasi menurut Abdullah (2008) menunjukkan bahwa sapi-sapi tersebut mengandung alel-alel sapi lain. Hal ini dimungkinkan karena di lokasi Tumbang Lahang telah dikembangkan sapi jenis Zebu, PO, Bali bahkan juga FH melalui berbagai program, baik dari Pemerintah maupun dari misionaris. Menurut Utomo et. al. (2011), misionaris bekerja di Tumbang Lahang diantaranya pada saat itu untuk membina masyarakat lokal guna melakukan kegiatan pertanian menetap. Dalam rangka mendukung kegiatan pertanian tersebut dikembangkan pula sapi-sapi (sapi Zebu) yang dapat membantu untuk mengolah lahan. Sapi-sapi introduksi tersebut ada yang dikawinsilangkan dengan sapi lokal setempat. Adanya kawin silang menimbulkan segregasi gen-gen sapi-sapi tersebut yang beragam dan meluas pada populasi sapi Katingan yang ada di Tumbang Lahang, dan membentuk performan sapi Katingan populasi Tumbang Lahang seperti sekarang ini. Menurut Karthickeyan et al. (2009), tidak adanya kegiatan seleksi seperti yang ada di lapangan,memunculkan alel observasi yang tinggi dimana keragaman genetiknya juga akan tinggi. Keragaman genetik ternak di Indonesia khususnya bangsa sapi telah banyak diteliti pada beberapa bangsa sapi, dan hasilnya menyatakan bahwa bangsa sapi tersebut bersifat polimorfik seperti yang disajikan pada Tabel 11. Tabel 11. Rataan Heterozigositas (Ĥ) pada Beberapa Bangsa Sapi di Indonesia Bangsa Ternak Lokus (Ĥ) Referensi Sapi Pesisir ILSTS006 0,71 Harmayanti (2004) Sapi Katingan ILSTS029 0,66 Purwanti (2011) Sapi Bali 16 lokus* 0,33 Winaya et al. (2007) Sapi Madura 16 lokus* 0,31 Winaya et al. (2007) Sapi Katingan HEL013 0,92 Hasil Penelitian Keterangan : (*) Terdiri dari BM2113, CSSM66, ETH3, ETH10, ETH152, ETH185, ETH225, HEL1, HEL9, ILSTS005, INRA023, INRA032, INRA035, INRA037, HAUT24 Crow (1986) menyatakan bahwa sebagian besar alel resesif yang bersifat lethal memiliki peluang yang semakin besar untuk terekspresi ketika derajat heterozigositas semakin menurun yang diakibatkan derajat inbreeding yang tinggi dan fragmentasi populasi. Tingginya keragaman genetik juga menandakan bahwa 28