KLONING FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA Bradyrhizobium japonicum MELALUI MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON.

Ukuran: px
Mulai penontonan dengan halaman:

Download "KLONING FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA Bradyrhizobium japonicum MELALUI MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON."

Transkripsi

1 KLONING FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA Bradyrhizobium japonicum MELALUI MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON Oleh: Rika Indri Astuti G DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2006

2 ABSTRAK RIKA INDRI ASTUTI. Kloning Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam- Aluminium pada Bradyrhizobium japonicum melalui mutagenesis dengan transposon. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan NISA RACHMANIA MUBARIK. Bakteri bintil akar Bradyrhizobium japonicum sensitif asam-aluminium telah berhasil dikonstruksi melalui metode mutagenesis dengan transposon untuk mengetahui gen yang terlibat dalam toleransi asam-aluminium pada B. japonicum. putmini-tn5km1 yang dibawa oleh Escherichia coli S17-1 (? pir) di transfer ke dalam sel B. japonicum toleran asam-al melalui konjugasi dengan tiga waktu inkubasi mating yang berbeda. Mutan BJ 11 (25) diketahui tidak mampu tumbuh pada media Ayanaba (ph 4.5) yang ditambahkan 50 µm aluminium. Fragmen DNA sebesar 0.8 kb berhasil diisolasi dari genom BJ 11 (25) menggunakan teknik inverse polymerase chain reaction (Inverse PCR). Fragmen DNA tersebut kemudian diklon ke dalam plasmid pgemt-easy (~3 kb) menghasilkan plasmid rekombinan yang didesain sebagai pgemt- 11 (~3.8kb). ABSTRACT RIKA INDRI ASTUTI. Cloning of Genomic DNA Fragment Involved for Acid-Al Tolerance in Bradyrhizobium japonicum using transposon mutagenesis. Under supervision of ARIS TRI WAHYUDI and NISA RACHMANIA MUBARIK. An acid-aluminium sensitive mutant of Bradyrhizobium japonicum 11, designated BJ 11 (25), was generated by mini-tn5 transposon mutagenesis to identify genes involved in acidaluminium tolerance in B. japonicum. Transposon delivery was carried out through conjugation between Escherichia coli S17-1 (? pir) carrying putmini-tn5km1 and acid-al tolerant B. japonicum with different of mating time. Frequency of transconjugation was in the range of cells per recipients. A mutant BJ 11 (25) did not able to grow on the Ayanaba medium (ph 4.5) containing 50 µm aluminium supplemented to the medium. A 0.8 kb of the genomic DNA fragment flanking transposon involved in acid-aluminium tolerance was successfully isolated by inverse polymerase chain reaction (Inverse PCR) from BJ 11 (25) genome. This fragment was subsequently cloned into pgem -T Easy (~3 kb) to yield a recombinant plasmid, designated as pgemt-38 (~3.8 kb).

3 KLONING FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA Bradyrhizobium japonicum MELALUI MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Oleh: Rika Indri Astuti G DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2006

4 JUDUL:KLONING FRAGMEN DNA YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM- ALUMINIUM PADA B radyrhizobium japonicum MELALUI MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON NAMA :RIKA INDRI ASTUTI NRP :G Menyetujui, Pembimbing I Pembimbing II Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si Dr. Nisa Rachmania M, M.Si NIP: NIP: Mengetahui, Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Penget ahuan Alam Dr. Ir. Yonny Koesmaryono NIP: Tanggal Lulus :

5 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Ponorogo pada tanggal 10 Oktober 1983 sebagai anak pertama dari dua bersaudara, putri dari pasangan Sriyanto dan Sujiati. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SDN 07 Pagi Jakarta Selatan pada tahun 1995 kemudian melanjutkan ke SLTP 226 Jakarta Selatan hingga lulus pada tahun Pendidikan menengah ditempuh di SMU Negeri 34 Jakarta. Pada tahun 2001 penulis lulus SMU dan pada tahun yang sama diterima di Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama mengikuti perkuliahan penulis menjadi asisten mata kuliah Biologi Dasar pada tahun ajaran 2003/2004, Biologi Alga dan Bryophyta pada semester genap tahun ajaran 2003/2004 dan 2004/2005, Mikrobiologi Dasar pada semester ganjil dan genap tahun ajaran 2004/2005, dan Fisiologi Mikroba pada tahun 2004/2005. Penulis melaksanankan Praktek Lapang (PL) di Lembaga Biologi Molekuler Eijkman Jakarta pada bulan Juni-Juli Kegiatan organisasi yang pernah diikuti penulis selama perkuliahan antara lain menjadi anggota Organisasi Studi Eksplorasi Alam Departemen Biologi IPB, OWA tahun Pada tahun 2004, penulis terpilih menjadi wakil Departemen Biologi dalam pemilihan Mahasiswa Berprestasi tingkat Fakultas Matematikan dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.

6 PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan hidayah-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah berjudul Kloning Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-Aluminium pada Bradyrhizobium japonicum Melalui Mutagenesis dengan Transposon ini disusun berdasarkan penelitian yang telah dilaksanakan mulai bulan Desember 2004 hingga Oktober Penelitian ini didanai oleh Proyek Hibah Bersaing XIII DIKTI tahun kepada Dr. Aris Tri Wahyudi melalui LPPM IPB. Pada kesempatan ini penulis menghaturkan ucapan ter imakasih yang mendalam kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si selaku dosen pembimbing I atas bimbingan dan arahan dalam bidang molekuler yang sangat berharga bagi penulis serta kepada Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si selaku Pembimbing II yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Serta kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin selaku dosen penguji dan wakil komisi pendidikan atas saran dan masukan yang berharga untuk perbaikan skripsi ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Iman Rusmana selaku Kepala Laboratorium Penelitian Mikrobiologi dan Prof. Dr. Antonius Suwanto selaku kepala Laboratorium Research Center for Microbial Diversity atas izin penggunaan sarana dan prasarana laboratorium, serta kepada seluruh staf laboratorium. Rasa terimakasih juga penulis sampaikan kepada Bapak, Ibu, Andri dan dede Adji untuk doa, dukungan dan kasih sayangnya. Kepada sahabat setiaku Henry Kurniawan atas motivasi, perhatian, sedih, senang dan kebersamaany a, kepada Ibu Ani dan Mbak Dini untuk segala bantuan dan kerjasama yang menyenangkan, kepada Hesti, Aries, Wulan dan Mba Elsie untuk kebersamaannya di Laboratorium, juga kepada seluruh peneliti Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Pak Joni, dan mahasiswa Biologi angkatan 38 yang telah banyak membantu penulis. Semoga karya ilmiah ini dapat membawa manfaat. Bogor, Desember 2005 Rika Indri Astuti

7 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... vii vii vii PENDAHULUAN... 1 Latar belakang... 1 Tujuan... 2 BAHAN DAN METODE... 2 Waktu dan Tempat Penelitian... 2 Bahan dan Alat... 2 Metode... 2 Peremajaan B. japonicum Toleran Asam-Al... 2 Mutagenesis dengan Transposon... 3 Seleksi Mutan... 3 Isolasi DNA Genom Mutan B. japonicum Sensitif Asam-Al... 4 Amplifikasi DNA Genom Pengapit Transposon dengan Inverse PCR... 4 Kloning Fragmen DNA Genom Pengapit Transposon... 5 HASIL Peremajaan B. japonicum Toleran Asam-Al... 7 Mutagenesis dengan Transposon... 7 Seleksi Mutan... 7 Amplifikasi DNA Genom Pengapit Transposon dengan Inverse PCR... 8 Kloning Fragmen DNA Genom Pengapit Transposon... 8 PEMBAHASAN Peremajaan B. japonicum Toleran Asam-Al... 9 Mutagenesis dengan Transposon... 9 Seleksi Mutan Amplifikasi DNA Genom Pengapit Transposon dengan Inverse PCR Kloning Fragmen DNA Genom Pengapit Transposon SIMPULAN SARAN DAFTAR PUSTAKA... 13

8 DAFTAR TABEL 1 Frekuensi transkonjugasi transposon mini-tn5km1 dari E. coli S 17-1 (? pir) ke B. japonicum pada berbagai waktu inkubasi mating Persentase pembentukan mutan sensitif asam-al... 8 Halaman DAFTAR GAMBAR Halaman 1 a) Peta plasmid put mini-tn5km1 (7.055 kb) yang berada dalam sel E. coli S17-1 (λ pir), b) peta restriksi transposon mini-tn5km1 (1.835 kb) yang membawa gen resistensi kanamisin Skema proses amplifikasi fragmen DNA genom pengapit transposon. a) DNA genom B. japonicum mutan sensistif asam -Al yang dipotong dengan enzim EcoRV, b) Proses sirkularisasi menggunakan enzim T4 DNA ligase, c) Proses amplifikasi DNA genom pengapit transposon dengan inverse PCR Penampilan koloni B. japonicum KDR 15, BJ 11, dan BJ 38 pada media YMA + MK % + Rif 50 µg/ml, setelah inkubasi 10 hari pada suhu ruang Penampilan koloni transkonjugan B. japonicum BJ 11 pada media YMA + MK % + Rif 50 µg/ml + Km 50 µg/ml Penampilan koloni mutan B. japonicum BJ 11 (umur 4 hari) pada media YMA + MK % + Rif 50 µg/ml + Km 50 µg/ml digunakan sebagai master plate Penampilan koloni mutan B. japonicum BJ 11 di media Ayanaba ( umur 5 hari) yang diinkubasi selama lima hari pada suhu ruang Hasil elektroforesis gel agarosa 1% dari DNA genom pengapit transposon yang diamplifikasi dengan inverse PCR dari genom mutan BJ 11. Sumur 1: marker DNA (1 kb ladder plus), sumur 2: DNA hasil inverse PCR (25) Peta plasmid rekombinan pgemt-11 (~3.8 kb) hasil ligasi fragmen DNA genom pengapit transposon (~0.8kb) dengan pgem T - Easy (~3kb) Hasil elektroforesis plasmid pgemt-11 yang dipotong dengan enzim EcoRI dan hasil verifikasi dengan PCR... 9 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Skema proses mutagenesis dengan transposon Komposisi media Ayanaba (Ayanaba, 1983)... 17

9 PENDAHULUAN Latar Belakang Keasaman tanah merupakan salah satu faktor pembatas bagi pertumbuhan dan perkembangan tanaman maupun mikrobiota tanah. Faktor keasaman tanah ini disebabkan rendahnya konsentrasi fosfor (P) dan tingginya konsentrasi aluminium (Al). Pada tanah basa, Al berada dalam bentuk anion yakni Al(OH) - 4, sedangkan pada tanah asam Al terdapat dalam bentuk kation Al 3+ dan hidroksi Al (Al (H 2 O) 3+ 6 ) yang bersifat toksik (Flis et al. 1992). Pada keadaan tanah asam pengaruh Al lebih besar dibandingkan P maupun ph rendah (Keyser & Munns 1979). Efektivitas sistem simbiosis antara bakteri bintil akar (BBA) dengan tanaman legum juga dipengaruhi oleh kondisi tanah. Keyser & Munns (1979) menyatakan bahwa Al dengan konsentrasi tinggi (50 µm) merupakan salah satu faktor cekaman yang dapat menghambat pertumbuhan dan memperpanjang fase lag BBA. Richardson et al. (1988) juga menyatakan bahwa konsentrasi Al sebesar 7.5 µm pada ph 4.8 dapat menghambat ekspresi gen nod pada BBA yang berperan untuk nodulasi. Selain itu, Goss et al. (1990) menyatakan bahwa tanah asam merupakan faktor pembatas bagi Rhizobium meliloti untuk menginvasi akar Medicago spp. dalam upaya membentuk bintil akar. Sealin itu, Johnson dan Wood (1990) menyatakan bahwa kation Al dapat mengikat PO 4 pada DNA sehingga menghambat proses replikasi DNA BBA. Galur -galur BBA yang toleran terhadap tanah asam sangat penting digunakan sebagai inokulan tanaman legum pada lahan pertanian asam. BBA berperan dalam memfiksasi nitrogen (N 2 ) dan mengubahnya menjadi amonium (NH + 4 ) yang dapat digunakan oleh tanaman sebagai simbionnya. Bradyrhizobium japonicum yang efektif dapat memenuhi 50% kebutuhan nitrogen tanaman kedelai (Tomkins et al. 2001) Beberapa galur BBA kedelai tumbuh lambat (Glycine max (L) Merrill) dari bakteri B. japonicum telah diketahui mampu tumbuh pada media Keyser dan Munns dengan ph 4.5. Beberapa galur di antaranya toleran terhadap konsentrasi Al yang tinggi, dibuktikan dengan kemampuannya tumbuh pada media Ayanaba yang mengandung Al 50 µm pada ph 4.5 (Endarini 1995). Keyser & Munns (1979) menyatakan bahwa tidak semua rhizobia toleran asam (ph 4.5-6) memiliki sifat toleran terhadap konsentrasi Al tinggi (50 µm). Sifat toleran asam-al pada B. japonicum disebabkan oleh kemampuannya untuk memelihara kestabilan ph internalnya mendekati basa saat ph eksternal menurun (O Hara et al. 1989), karena kemampuan ini maka bentuk Al yang toksik akan berkurang toksisitasnya jika masuk ke dalam sel (Flis et al ). Selain itu B. japonicum tahan asam-al juga mampu mengekstraksi senyawa alkalin ke lingkungan untuk meningkatkan ph eksternal (Jordan 1984). Penelitian mengenai B. japonicum toleran asam Al indigenus telah banyak dilaporkan. Pada tahun 1995, Endarini et al. melakukan seleksi galur-galur B. japonicum indigenus toleran media asam-al. Penelitian mengenai transfer gen inaz pada beberapa galur B. japonicum toleran asam-al dilakukan oleh Ariyani et al. (1999). Selain itu, pada tahun 2001 Sakinah et al. melakukan uji aktivitas ekstrak kasar enzim protokatekuat 3,4 dioksigenase dari beberapa galur B. japonicum. Namun demikian, telaah mengenai gen yang bertanggung jawab terhadap sifat toleran asam-al B. japonicum indigenus belum dilakukan. Saat ini, mutagenesis dengan transposon merupakan teknik yang bany ak digunakan untuk keperluan analisis genetika molekuler pada berbagai macam bakteri (Voelker & Dybvig 1998) dan fungi (Firon et al. 2003). Transposon merupakan elemen DNA yang dapat loncat atau menyisip dari satu tempat ke tempat lainnya dalam DNA (Snyder & Champness 2003). Mutagenesis dengan transposon telah digunakan oleh Autret et al. (2001) untuk mengidentifikasi gen yang terlibat dalam sifat virulensi bakteri patogen pada manusia, Listeria monocytogenes. Selain itu Wahyudi et al. (1998) menggunakan transposon untuk keperluan analisis gen-gen penanda molekuler pada B. japonicum. Teknik mutagenesis ini juga digunakan oleh Wahyudi et al. (2001) untuk mengisolasi mutan defektif dalam pembentukan partikel magnet pada Magnetospirillum magneticum guna mengetahui gen yang berperan dalam sintesis partikel magnet. Transposon yang sering digunakan untuk mutagenesis pada bakteri gram negatif ialah Tn5 (B ruijn & Lupski 1984). Hal ini karena Tn5 memiliki frekuensi transposisi yang tinggi, spesifisitas sekuen DNA target yang relatif rendah (Goryshin et al. 1998), dan sedikit memiliki homologi dengan sekuen DNA genom beberapa spesies bakteri (Berg & Berg 1983). Transposon yang digunakan

10 dalam penelitian ini ialah mini-tn5km1 yang membawa gen penanda resistensi terhadap kanamisin. Mini -Tn5Km1 merupakan salah satu tipe transposon turunan dari transposon Tn5 (de Lorenzo et al. 1990). Transposon ini dapat menyisip secara acak pada genom bakteri dan penyisipannya bersifat stabil (Herrero et al. 1990). Penyisipan mini-tn5km1 ke dalam genom akan menyebabkan bakteri tersebut memiliki sifat resisten terhadap kanamisin. Dalam penelitian ini, mutagenesis dengan transposon digunakan untuk mendapatkan mutan B. japonicum yang sensitif asam-al sedangkan untuk mengetahui daerah penyisipan transposon digunakan teknik inverse PCR (Huang et al. 2000; Wahyudi et al. 2001). Daerah sisipan (flanking DNA) merupakan lokasi gen yang diduga berperan dalam sifat toleran asam-al. Selanjutnya, dilakukan kloning fragmen DNA pengapit transposon tersebut ke dalam sel E. coli DH5a dengan transformasi. Karakterisasi parsial tersebut diharapkan menjadi langkah awal untuk karakterisasi lebih lanjut guna memperoleh sekuen gen lengkap yang berperan dalam sifat toleransi asam-al pada B. japonicum. Tujuan Melakukan kloning fragmen DNA genom B. japonicum yang terlibat dalam toleransi asam-al melalui mutagenesis dengan transposon. BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Desember 2004 hingga Oktober 2005 di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Research Center for Microbial Diversity (RCMD), Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah B. japonicum toleran asam-al galur KDR 15, BJ 11, dan BJ 38. Galur -galur tersebut diperoleh dari hasil penelitian Tedja-Imas et al. (1994) dan Endarini et al. (1995). Escherichia coli yang membawa putmini-tn5km1 (E. coli S-17-1 (λ pir)) digunakan sebagai donor dalam proses transposon mutagenesis. B. japonicum secara rutin ditumbuhkan pada media Yeast Extract Manitol Agar (YMA) (manitol 10 g/l, K 2 HPO g/l, MgSO 4.7H 2 O 0.2 g/l, NaCl 0.2 g/l, ekstrak khamir 5 g/l) + merah kongo %. Sedangkan E. coli S-17-1 (λ pir) secara rutin ditumbuhkan pada media Luria Agar (LA) dengan komposisi media: tripton 10 g/l, NaCl 10 g/l, ekstrak khamir 5 g/l, agaragar 15 g/l + kanamisin 50 µg/ml. Media lain yang digunakan ialah Luria Agar modifikasi dengan kadar NaCl 10% dari komposisi media LA (tripton 5 g/l, NaCl 1 g/l, ekstrak khamir 5 g/l, agar-agar 15 g/l). Selain itu juga digunakan media LB (komposisi media LA tanpa penambahan agar-agar), dan media LB modifikasi (komposisi media LA modifikasi tanpa penambahan agar-agar). Pada proses seleksi mutan digunakan media Ayanaba (Ayanaba et al. 1983). Bahan kimia yang digunakan kanamisin (Km) 50 µg/ml, ampisilin (Ap) 50 µg/ml, rifampisin (Rif) 100 µg/ml, merah kongo (MK), NaCl 0.85 %, etanol 70% dan 100%, alkohol 95%, etidium bromida, bufer TE 1X (10mM Tris ph ; 1mM EDTA) dan agarosa. Bahan yang digunakan untuk tahapan inverse PCR dan persiapannya ialah sebagai berikut: (a) proses pemotongan DNA genom menggunakan satu unit enzim restriksi EcoRV (Promega);(b) bahan untuk PCR yang digunakan ialah ddh2o steril, PCR buffer, dntp, primer hulu KmO (5 -ACACTGATGAATGTTCCGTT G-3 ) dan primer hilir KmI (5 -ACCTGCAG GCATGCAAGCTTC-3 ) serta LA Taq Polymerase (Takara) (c) bahan yang digunakan untuk proses ligasi ialah enzim T4 DNA ligase, bufer ligasi, bovin serum albumin (BSA), dan ddh 2 O steril. Proses transformasi dan persiapannya diawali dengan: purifikasi DNA dengan menggunakan metode Wizard SV Gel & PCR Clean-up System (Promega, USA). Selanjutnya dilakukan proses ligasi.komponen ligasi yang digunakan ialah bufer ligasi, enzim T4 DNA ligase (Promega), pgemt-easy (amp r ; Promega) dan DNA sisipan. Untuk penyiapan sel kompeten diperlukan isolat sel inang E. coli DH5a yang ditumbuhkan pada media LB, larutan CaCl 2 dingin (CaCl M, Tris HCl 5 mm, MgCl 2 5 mm pada ph 7). Untuk proses transformasi diperlukan larutan A (glukosa 50 mm, Tris-Cl [ph 8], EDTA 10 mm [ph 8]), larutan B (0.2 M NaOH; 1% (b/v) SDS), dan larutan C (CH3COOK 5M, asam asetat glasial, akuades) Untuk proses seleksi transforman diperlukan media LA+ Ap 50 µg/ml + X -gal 40 µg/ml. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini ialah inkubator, laminar air flow cabinet (Jouan), filter milipore (poripori 0.45 µm), mesin sentrifuse (Jouan), ph

11 meter (Hanna Instruments, Jerman), mesin PCR 2400 (Perkin-Elmer), piranti elektroforesis (BioRad, USA), UV transilluminator, kamera (Polaroid DS-34, USA), dan alat laboratorium umum lainnya. Metode Peremajaan B. japonicum Toleran Asam- Al. B. japonicum yang berada dalam ruang penyimpanan diremajakan kembali dengan menginokulasikan koloni yang ada ke dalam agar miring YMA yang baru dan steril. Kondisi inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 7-8 hari, kemudian masing-masing biakan digoreskan pada cawan YMA+ merah kongo % + Rif 50 µg/ ml. B. japonicum diketahui resisten terhadap rifampisin (Wahyudi 1996). Mutagenesis dengan Transposon. Konstruksi mutan B. japonicum sensitif asam- Al dilakukan dengan menyisipkan transposon mini-tn5km1, yang dibawa plasmid putmini-tn5km1 (Gambar 1) dalam E. coli S 17-1 (λ pir) ke dalam genom B. japonicum secara diparental mating (Lampiran 1). Pada proses mutagenesis ini, E. coli S 17-1 (λ pir) disebut sebagai donor (D) dan B. japonicum disebut sebagai resipien (R). Biakan R ditumbuhkan pada 50 ml Yeast Mannitol Broth (YMB) + Rif 100 µg/ml dalam erlenmeyer 250 ml. Selanj utnya diinkubasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 140 rpm, pada suhu ruang selama 60 jam. Sementara itu biakan D ditumbuhkan pada media LB 50 ml + Km 50 µg/ml dalam erlenmeyer 250 ml. Inkubasi dilakukan dalam inkubator bergoyang dengan kecepatan 140 rpm, suhu 37 0 C selama jam. JumLah sel R dan D pada masing-masing media kaldu dihitung dengan menggunakan hemasitometer Neubauer. Perbandingan jumlah sel donor dengan resipien yang digunakan ialah 1:1 (pada kisaran 10 8 :10 8 ). Sesuai dengan perbandingan tersebut diambil volume tertentu dari kultur dan dipanen selnya. Sel R dicuci dan diresupensi dalam garam fisiologis (NaCl 0.85%) sebanyak 3 kali dengan cara disentrifugasi selama 10 menit pada g. Supernatan yang didapat dibuang, dan pelet dicuci dengan garam fisiologis, demikian pula bagi sel D, namun sel D disentrifugasi pada 800 g selama 5 menit. Pelet sel R yang telah dipanen ditambahkan LB modifikasi sebanyak 40µL. Suspensi sel R kemudian dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml yang berisi pelet sel D. Suspensi campuran D dan R kemudian diresuspensi perlahan dan dipindahkan ke atas membran milipore steril yang diletakkan di atas media LA modifikasi. Inkubasi dilakukan selama 12, 18, dan 24 jam. Pelet sel donor dan resipien juga diletakkan di atas membran milipore sebagai kontrol negatif. Pada masing-masing jam inkubasi yang telah ditentukan, membran milipore diangkat dan dimasukkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml yang berisi 1 ml garam fisiologis, kemudian dikocok dengan kocok untuk melepaskan sel dari membran. Tiap 100 µl suspensi disebarkan di atas media YMA + Rif 50 µg/ml + Km 50 µg/ml + MK % dan diinkubasi selama 5-7 hari. a) b) Gambar 1. a) Peta plasmid put mini- Tn5Km1 (7.055 kb) yang berada dalam sel E. coli S17-1 (λ pir), b) peta restriksi transposon mini-tn5km1 (1.835 kb) yang membawa gen resistensi kanamisin. Seleksi Mutan. Sel transkonjugan yang tumbuh pada masing-masing cawan YMA + MK % + Rif 50 µg/ml + Km 50 µg/ml dibuat replikanya pada media yang sama. Kemudian tiap koloni pada cawan replika dipindahkan pada media Ayanaba (ph 4.5) yang ditambahkan 50 µm Al (Lampiran 2). Penambahan NaOH atau HCl untuk penetapan ph media dilakukan sebelum dan setelah sterilisasi. Inkubasi dilakukan pada suhu 28 0 C. Koloni yang tidak menampakkan pertumbuhan merupakan koloni B. japonicum yang sensitif terhadap asam dan Al.

12 Selanjutnya setiap mutan B. japonicum sensitif asam-al dilakukan verifikasi ulang pada media Ayanaba dengan menggoreskan satu lup penuh koloni mutan. Jika tidak terdapat pertumbuhan maka koloni B. japonicum tersebut yang akan digunakan untuk telaah molekuler. Isolasi DNA Genom Mutan B. japonicum Sensitif Asam -Al. Isolasi DNA genom dilakukan dengan menggunakan metode CTAB (Sambrook & Russel 2001). Sel mutan B. japonicum terlebih dahulu diproduksi dengan menginokulasikan satu lup penuh biakan ke dalam 50 ml media cair YMB + Rif 50 µg/ml + Kan 50 µg/ml yang diinkubasi selama 4-5 hari, pada suhu ruang di inkubator bergoyang dengan kecepatan 60 rpm. Sebanyak 50 ml kultur sel mutan B. japonicum diambil dan dimasukkan ke dalam 2 tabung sentrifugasi 50 ml steril masing-masing 25 ml. Kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 8500 g. Pelet yang didapat kemudian diresuspensi dengan 250 µl bufer TE (1X), dan dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml steril. Kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan 9000 g. selama 10 menit, proses ini diulang 2-3 kali. Suspensi kemudian ditambahkan 5 µl lisozim, tabung mikro 1.5 ml dibolak-balik untuk mempercepat lisis sel. Selanjutnya, suspensi diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 30 menit. Proses lisis sel dilan jutkan dengan menambahkan 500 µl SDS 10% dan proteinase K sebanyak 10 µl, tabung mikro 1.5 ml kemudian dibolak-balik. Suspensi diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 60 menit. Sebanyak 80 µl NaCl dan 100 µl CTAB 10% ditambahkan ke dalam suspensi, kemudian diinkubasi pada suhu 65 0 C selama 20 menit, tabung kembali dibolak-balik. Purifikasi DNA dan pengendapan debris sel dilakukan dengan menambahkan 650 µl fenol : kloroform : isoamilalkohol (25:24:1). DNA dipisahkan dari debris sel dengan cara disentrifugasi pada g selama 10 menit. Supernatan yang mengandung DNA dipurifikasi dengan menambahkan 650 µl kloroform :isoamil alkohol (24:1) dan selanjutnya disentrifugasi pada g selama 10 menit. Untuk pengendapan DNA, supernatan yang didapat ditambahkan etanol absolut sebanyak 2 kali volume supernatan dan sodium asetat 3M 10 % volume, pengendapan dibantu dengan inkubasi di dalam mesin pembeku (-20 0 C) selama 30 menit dan kemudian dilakukan sentrifugasi pada g selama 15 menit. Pelet yang didapatkan ditambahkan 70% etanol dingin untuk mengikat air. Suspensi kembali disentrifugasi (13000 g; 15 menit), fase supernatan dibuang sedangkan pelet dikeringudarakan dengan cara membuka tutup tabung mikro 1.5 ml dan dibiarkan selama beberapa jam (2-3 jam). Kemudian pelet DNA dilarutkan dalam 20 µl ddh 2 O steril. Amplifikasi DNA Genom Pengapit Transposon dengan Inverse PCR. Proses amplifikasi dengan teknik inverse PCR ter diri atas 2 tahap yakni penyiapan DNA cetakan dan amplifikasi dengan inverse PCR. DNA cetakan yang digunakan untuk inverse PCR ialah DNA hasil pemotongan dengan enzim EcoRV dan diligasi dengan enzim T4 DNA ligase. Pemotongan DNA dilakukan dengan mencampurkan berturutturut bufer restriksi 2 µl, BSA 1 µl, dan enzim EcoRV 0.1 µl, kemudian campuran ditera dengan ddh 2 O hingga volume akhir 20 µl. Campuran diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 3 jam (Gambar 2a). DNA yang telah dipotong dengan enzim EcoRV kemudian diekstraksi dengan menggunakan metode ekstraksi fenol/kloroform. Proses ekstraksi dilakukan dengan menambahkan 80 µl ddh 2 O pada tabung mikro 1.5 ml yang berisi DNA hasil pemotongan dengan enzim EcoRV. Kemudian ditambahkan larutan fenol: kloroform: isoamilalkohol (25:24:1) satu kali volume DNA (100 µl). Suspensi tersebut kemudian disentrifugasi pada g selama 15 menit, fase aquosa kemudian dipindahkan pada tabung mikro 1.5 ml baru dan steril. Kemudian DNA dipresipitasi dengan etanol absolut dan 0.1 volume sodium asetat 3 M, untuk kemudian diinkubasi pada C selama 30 menit. DNA yang terpotong kemudian dicuci dua kali dengan menggunakan etanol 70% dan disentrifugasi pada g selama 15 menit. Pelet DNA kemudian dikeringudarakan selama 2-3 jam. Pelet DNA dilarutkan dalam 5 µl ddh 2 O steril. DNA yang telah dipotong kemudian diligasi dengan menggunakan enzim T4 DNA ligase. Proses ligasi berperan dalam pembentukan lingkaran monomerik dari DNA yang akan dijadikan template dalam proses inverse PCR (Gambar 2b). Ligasi dilakukan dengan mencampurkan bufer ligase sebanyak 2 µl, DNA sebanyak 5 µl,

13 enzim T4 DNA ligase sebanyak 1 µl, campuran dilarutkan dengan ddh 2 O hingga volume reaksi 20 µl. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 4 0 C selama semalam (Gambar 2b). Fragmen DNA genom yang mengapit transposon pada mutan B. japonicum diamplifikasi dengan menggunakan teknik inverse PCR (Gambar 2c). Fragmen sirkuler DNA yang mengapit transposon mini-tn5km1 diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR pada reaksi campuran dengan volume total 50 µl yang mengandung 8 µl dntp, 25 µl GC buffer II, 0.5 µl LA Taq Polymerase, masing-masing 1µL primer KmI dan KmO dengan konsentrasi 10 pmol kemudian ditambahkan DNA (hasil ligasi) sebanyak 6µL. Campuran ditera dengan ddh 2 O hingga volume akhir 50 µl. Proses denaturasi DNA cetakan dilakukan pada suhu 95 0 C selama 2 menit, annealing pada 58 0 C selama 1 menit dan elongasi pada suhu 72 0 C selama 1 menit dan 10 menit untuk siklus terakhir. DNA diamplifikasi sebanyak 30 siklus. Produk PCR kemudian dielektroforesis pada 1% agarosa untuk mendeterminasi ukuran fragmen. Kloning Fragmen DNA Genom Pengapit Transposon. Proses kloning fragmen DNA ini meliputi beberapa tahapan yakni purifikasi fragmen DNA hasil inverse PCR, ligasi DNA sisipan hasil purifikasi ke dalam plasmid pgemt-easy, transformasi plasmid rekombinan ke dalam sel E. coli DH5a, dan verifikasi dengan memotong plasmid rekombinan dengan enzim EcoRI. Purifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard SV Gel & PCR Clean-up System (Promega, USA). Metode purifikasi ini berperan dalam mengisolasi DNA dari gel agarosa hasil elektroforesis. Setelah elektroforesis, gel yang berisi pita DNA yang dikehendaki dipotong dan hasil cacahan dari gel tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikro 1. 5 ml. Kemudian ke dalam tabung tersebut ditambahkan 10 µl membran e binding solution per 10 mg cacahan gel, lalu dikocok dan diinkubasi pada suhu o C sampai gel benar-benar larut. Setelah melarutkan gel dilakukan pengikatan DNA dengan memasukkan campuran gel ke dalam tabung penampung yang dilengkapi dengan minikolom dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit. Selanjutnya tabung penampung tersebut disentrifugasi pada kecepatan g selama 1 menit, cairan yang melewati minikolom dibuang dan minikolom dimasukkan kembali pada tabung penampung. Proses pencucian dilakukan dengan menambahkan 700 µl membrane wash solution yang mengandung etanol dan disentifugasi pada kecepatan g selama 1 menit. Cairan dibuang dan minikolom dimasukkan kembali pada tabung penampung. EcoRV c) b) a) b) EcoRV c) EcoRV Gambar 2. Skema proses amplifikasi fragmen DNA genom pengapit transposon. a) DNA genom B. japonicum mutan sensistif asam-al yang dipotong dengan enzim EcoRV, b) Proses sirkularisasi menggunakan enzim T4 DNA ligase, c) Proses amplifikasi DNA genom pengapit transposon dengan inverse PCR.

14 Tahap pencucian diulang dengan menambahkan 500 µl membrane wash solution dan disentrifugasi kembali pada kecepatan yang sama selama 5 menit. Untuk proses elusi, minikolom dipindahkan dengan hati-hati pada tabung mikro 1.5 ml yang baru dan ditambahkan 50 µl air bebas nuklease pada minikolom. Lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit dan disentrifugasi pada kecepatan g selama 1 menit. Minikolom dibuang dan DNA yang tertampung pada tabung mikro 1.5 ml disimpan pada suhu 4 o C atau 20 o C. DNA hasil purifikasi kemudian digunakan sebagai DNA sisipan untuk diligasikan ke dalam vektor plasmid pgemt-easy. Ligasi dilakukan dengan mencampurkan berturut -turut bufer ligase 2 µl, DNA 2 µl, dan enzim T4 DNA ligase 1 µl. Campuran kemudian dilarutkan dengan ddh 2 O hingga volume reaksi 20 µl dan kemudian diinkubasi pada suhu optimum ligasi (4 0 C, semalam). Plasmid rekombinan yang terbentuk kemudian ditransformasi ke dalam sel E. coli DH5a. Tahap awal proses transformasi ialah penyiapan sel kompeten. Pembentukan sel kompeten dilakukan dengan menggunakan larutan CaCl 2 dingin. Sebanyak satu lup sel E. coli DH5a ditumbuhkan pada media LB 25 ml, dan diinkubasi selama 16 jam dan suhu 37 0 C pada inkubator bergoyang 150 rpm. Sel E. coli DH5a kemudian disubkultur pada kondisi dan media yang sama selama 3 jam. Sebanyak 1.5 ml kultur dimasukkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml steril dan disentrifugasi pada 2300 g selama 2 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang sedangkan pelet diresuspensi dengan larutan CaCl 2 dan diinkubasi di es 20 menit untuk kemudian disentrifugasi pada 2300 g selama 2 menit. Pelet kemudian dicuci dengan larutan CaCl 2 dan diinkubasi di dalam es selama 10 menit. Transformasi dilakukan dengan menggunakan metode renjatan panas (Sambrook & Russel 2001). Transformasi diawali dengan mencampurkan 200 µl sel kompeten dengan 3 µl plasmid rekombinan. Suspensi kemudian diinkubasi selama 1 menit pada suhu 42 0 C (renjatan panas) dan dengan segera diinkubasi di es selama 2 menit. Sebanyak 250 µl media LB ditambahkan ke dalam suspensi, untuk kemudian diinkubasi pada inkubator bergoyang (150 rpm) selama satu jam pada suhu 37 0 C. Suspensi selanjutnya disentrifugasi pada 2300 g selama 2 menit, pelet yang terbentuk diresuspensi dengan 200 µl LB. Sebanyak 100 µl suspensi disebar pada media LA + Ap 50 µg/ml + X-gal 40µg/mL. Sel E. coli DH5a rekombinan akan menampilkan koloni berwarna putih. Beberapa koloni putih yang terbentuk kemudian dikulturkan di media LB untuk keperluan isolasi plasmid dan verifikasi. Tahap awal isolasi plasmid dilakukan dengan memanen sel E. coli DH5a rekombinan dari 1.5 ml kultur. Pelet yang terbentuk ditambahkan 100µL larutan A dan kemudian dikocok. Suspensi kemudian ditambahkan 125 µl larutan B dan 375 µllarutan C, tabung dibolak-balik perlahan untuk memacu lisis. Suspensi kemudian disentrifugasi (2300 g, 15 menit), supernatan yang terbentuk dipindahkan ke tabung mikro 1.5 ml baru. Presipitasi plasmid dilakukan dengan menambahkan etanol absolut dan sodium asetat 3 M (10 % volume total). Kemudian suspensi dicuci dengan etanol 70%. Plasmid rekombinan yang terisolasi dilarutkan dengan 10 µl ddh 20. Verifikasi dilakukan dengan melakukan proses digesti plasmid rekombinan dengan enzim EcoRI. Digesti dilakukan dengan mencampurkan 2 µl plasmid rekombinan, 2 µl bufer res triksi dan 0.5 µl enzim EcoRI. Suspensi kemudian diinkubasi pada suhu optimum enzim restriksi (37 0 C selama 3 jam ). Visualisasi hasil restriksi dilakukan dengan cara elektroforesis pada gel agarosa 1%. Hasil pemotongan plasmid rekombinan yang mencirikan keberadaan fragmen DNA insert (DNA pengapit transposon) kemudian diverifikasi kembali melaui PCR menggunakan primer KmO dan KmI, dengan plasmid rekombinan sebagai template annealing. Verifikasi dengan PCR dilakukan pada 50µL reaksi yang terdiri dari 8 µl dntp, 25 µl GC buffer I, 0.5 µl LA Taq Polymerase, masing-masing 1µL primer KmI dan KmO dengan konsentrasi 10 pmol kemudian ditambahkan DNA plasmid rekombinan sebanyak 1µL. Campuran ditera dengan ddh2o hingga volume akhir 50 µl. Proses denaturasi DNA cetakan dilakukan pada suhu 95 0 C selama 2 menit, annealing pada 58 0 C selama 1 menit dan elongasi pada suhu 72 0 C selama 1 menit dan 10 menit untuk siklus terakhir. DNA diamplifikasi sebanyak 30 siklus. Produk PCR kemudian dielektroforesis pada 1% agarosa untuk mendeterminasi ukuran fragmen DNA sisipan (insert).

15 HASIL Peremajaan B. japonicum Toleran asam-al B. japonicum galur KDR 15, BJ 11 dan BJ 38 telah berhasil diremajakan di dalam media YMA + merah kongo % + Rif 50 µg/ml (Gambar 3). Koloni ketiga galur B. japonicum ini berbentuk bulat, berwarna putih, elevasi cembung, dengan diameter koloni melebihi 1 mm setelah inkubasi 10 hari pada suhu ruang dan memiliki konsistensi lengket dan berlendir. Tipe koloni KDR 15, BJ 38 dan BJ 11 umumnya disebut dengan tipe large watery Gambar 4. Penampilan koloni transkonjugan B. japonicum BJ 11 pada media YMA + MK % + Rif 50 µg/ml + Km 50 µg/ml. Seleksi Mutan Seleksi diawali dengan mereplika hasil sebar B. japonicum hasil mating pada pada media YMA + MK % + Rif 50 µg/ml + Km 50 µg/ml (Gambar 5). Hanya sel B. japonicum yang tersisipi mini-tn5 Km1 saja yang mampu tumbuh pada media tersebut. Gambar 3. Penampilan koloni B. japonicum KDR 15, BJ 11, dan BJ 38 pada media YMA + MK % + Rif 50 µg/ml setelah inkubasi 10 hari pada suhu ruang. Mutagenesis dengan Transposon Frekuensi transkonjugasi tertinggi untuk B. japonicum KDR 15 dan BJ 11 didapatkan pada waktu inkubasi 24 jam, sedangkan untuk B. japonicum BJ 38 didapatkan pada waktu inkubasi 18 jam. Rata-rata frekuensi konjugasi untuk ketiga galur berada pada kisaran sel/ resipien (Tabel 1). Pada proses mutagensesis ini didapatkan koloni transkonjugan yang cukup banyak (Gambar 4). Hasil sebar koloni transkonjugan B. japonicum galur KDR 15 dan BJ 38 memperlihatkan penampilan koloni yang sama. Sel transkonjugan merupakan sel B. japonicum yan g genomnya tersisipi mini - Tn5Km1 sehingga memiliki sifat resistensi kanamisin. Gambar 5. Penampilan koloni mutan B. japonicum BJ 11 (umur 4 hari) pada media YMA + MK % + Rif 50 µg/ml + Km 50 µg/ml. Hasil replika tersebut kemudian dijadikan master plate untuk koloni B. japonicum yang diuji ke media Ayanaba yang mengandung Al 50µM pada ph 4.5 (Gambar 6). Koloni B. japonicum yang tidak mampu tumbuh pada media Ayanaba dipilih untuk diuji lebih lanjut. Tabel 1 Frekuensi transkonjugasi transposon mini-tn5km1 dari E. coli S 17-1 (? pir) ke B. japonicum pada berbagai waktu inkubasi mating Konjugasi bakteri B. japonicum KDR 15 x E. coli S-17-1 (λ pir) Frekuensi transkonjugasi 12 jam 18 jam 24 jam Rata-Rata 3.4 x x x x 10-6 B. japonicum BJ 11 x E. coli S-17-1 (λ pir) 6.7 x x x x 10-6 B. japonicum BJ 38 x E. coli S-17-1 ( λ pir) 6.1 x x x x 10-7

16 kb 1 2 WT X Gambar 6. Penampilan koloni mutan B. japonicum BJ 11 di media Ayanaba (umur 5 hari). Tanda X merupakan koloni B. japonicum BJ 11 yang sensitif asam-al. WT: wild type. Dari proses seleksi mutan didapatkan satu mutan sensitif asam-al dari B. japonicum galur KDR 15, tiga mutan dari galur BJ 11 dan satu mutan dari BJ 38. Nomor sandi untuk mutan B. japonicum KDR 15 ialah KDR 15 (30), untuk BJ 11 ialah BJ 11 (24), BJ 11 (25), dan BJ 11 (37) dan untuk BJ 38 ialah BJ 38 (22). Persentase pembentukan mutan B. japonicum sensitif asam-al terendah terjadi pada galur KDR 15, sedangkan tertinggi terjadi pada galur BJ38. Persentase pembentukan mutan ini sangat tergantung dari jumlah koloni transkonjugan yang didapatkan (Tabel 2) ~0.8 kb Gambar 7. Hasil elektroforesis gel agarosa 1% dari DNA genom pengapit transposon yang diamplifikasi dengan inverse PCR dari genom mutan BJ 11. Sumur 1: marker DNA (1 kb ladder plus), sumur 2: DNA hasil inverse PCR. Kloning Fragmen DNA Genom Pengapit Transposon Fragmen DNA pengapit transposon telah berhasil diligasi kedalam vektor plasmid pgemt-easy (~3 kb) membentuk plas mid rekombinan pgemt-11 (~3.8 kb) (Gambar 8). pgemt-11 juga telah berhasil ditransformasi ke dalam sel E. coli DH5a. Dua k oloni putih hasil transformasi dipilih untuk verifikasi plasmid rekombinan. B. japonicum Jumlah koloni Jumlah mutan B. japonicum Persentase terbentuknya transkonjugan sensitif asam-al mutan sensitif asam-al (%) KDR BJ 11 BJ38 Tabel 2 Persentase pembentukan mutan sensitif asam-al Amplifikasi DNA Genom Pengapit Transposon dengan Inverse PCR Pertumbuhan sel mutan BJ 11 (25) relatif lebih mudah dibandingkan dengan sel mutan dari galur lain sehingga galur ini dipilih untuk telaah molekuler lebih lanjut. Hasil inverse PCR menunjukkan ukuran fragmen DNA sebesar 0.8 kb (Gambar 7) yang diduga memiliki peranan dalam sifat toleransi asam-al B. japonicum galur BJ 11. DNA genom pengapit transposon (~0.8 kb) Gambar 8. Peta Plasmid rekombinan pgemt-11 (~3.8 kb) hasil ligasi fragmen DNA genom pengapit transposon (~0.8kb) dengan pgemt- Easy (~3kb).

17 kb Hasil verifikasi plasmid rekombinan pgemt-11 pada gel agarosa 1% memperlihatkan dua pita yang masing-masing berukuran 3 kb dan 0.8 kb. Pita DNA berukuran 3 kb mencirikan keberadaan vektor plasmid pgemt-easy. Sedangkan pita DNA yang berurukuran 0.8 kb mencirikan keberadaan DNA genom pengapit transposon. Adanya amplikon sebesar 0.8 kb hasil verifikasi dengan PCR menggunakan primer KmO dan KmI dari DNA insert (pengapit transposon) juga menguatkan keberhasilan proses kloning yang dilakukan (Gambar 9) Gambar 9. Hasil elektroforesis plasmid pgemt-11 yang dipotong dengan enzim EcoRI dan hasil verifikasi dengan PCR. Pada sumur 2 dan 3 terdapat dua pita yang berukuran ~3 kb (pgemt-easy) dan ~0.8 kb (DNA genom pengapit transposon) hasil pemotongan EcoRI. Sumur 4 dan 5 menunjukkan adanya amplikon hasil PCR dari fragmen 0.8 kb. Sumur 1: marker DNA (1 kb ladder plus ). PEMBAHASAN ~3 kb (pgemt-easy) ~0.8 kb (DNA genom pengapit transposon) Peremajaan B. japonicum Toleran Asam -Al Bradyrhizobium umumnya tumbuh lambat pada media YMA, yakni berkisar 5 hingga 7 hari (Jordan 1984). Manitol merupakan sumber karbon yang dapat digunakan oleh B. japonicum dalam media tersebut. Merah kongo yang digunakan dalam media ini berperan dalam membedakan antara koloni B. japonicum dengan kontaminan. Menurut Somasegaran dan Hoben (1994), B. japonicum umumnya kurang atau tidak mampu menyerap warna merah kongo pada konsentrasi % yang ditambahkan pada media YMA jika diinkubasi pada ruang gelap, sedangkan organisme kontaminan akan menyerap kuat warna merah tersebut. Konsistensi lengket dan berlendir yang dimiliki oleh B. japonicum disebabkan oleh adanya lendir pada permukaan selnya. Menurut Jordan (1984) lendir yang dihasilkan sebagian besar ialah lipopolisakarida ekstraselular. Ciri -ciri tipe koloni KDR 15, BJ 38 dan BJ 11 umumnya disebut dengan tipe large watery. Menurut Keyser & Munns (1979) galur-galur B. japonicum yang menghasilkan lendir banyak atau memiliki tipe koloni large watery lebih memiliki sifat toleran terhadap kondisi asam dibandingkan tipe koloni yang sedikit menghasilkan lendir atau yang biasa disebut dengan tipe koloni small dry (kering). B. japonicum telah diketahui memiliki sifat resistensi terhadap antibiotik rifampisin (100 µg/ ml), tetrasiklin (100 µg/ml) dan ampisilin (100 µg/ ml). Namun, B. japonicum tidak mampu tumbuh pada media yang mengandung antibiotik kanamisin (50 dan 100 µg/ml) (Wahyudi 1996). Sifat sensitivitas terhadap kanamisin ini merupakan salah satu alasan penggunaan transposon mini -Tn5Km1, dengan kanamisin digunakan untuk seleksi mutan. Mutagenesis dengan Transposon Waktu inkubasi konjugasi selama 24 jam memperlihatkan frekuensi konjugasi terbesar untuk B. japonicum KDR 15 dan BJ 11. Pada proses konjugasi B. japonicum KDR 15 dengan E. coli S 17-1 (? pir), konsentrasi sel B. japonicum dan E. coli yang digunakan berkisar 6.3 x 10 8 sel /ml. Sedangkan pada B. japonicum BJ 11 digunakan konsentrasi sel berkisar 1.9 x 10 8 sel /ml. Kisaran konsentrasi resipien yang sama (~ ) juga digunakan oleh Fodor et al. (2001) ketika melakukan konjugasi antara Thiocapsa roseopersicina dengan sel E. coli S 17-1 (? pir) yang membawa Tn5, dan dari hasil konjugasi ini didapatkan frekuensi transkonjugasi sebesar Wahyudi et al. (1998) juga melakukan mutagenesis dengan transposon pada B. japonicum asam-al dengan nomor galur BJ 11, BJ 33 dan BJ 43. Frekuensi transkonjugasi yang didapatkan secara berurut ialah 3.6 x 10-9, 2.8 x 10-9, dan 5.7 x 10-9 setelah inkubasi konjugasi selama semalam. Jika rata-rata frekuensi konjugasi galur BJ 11, KDR 15 dan BJ 38 dibandingkan maka didapatkan data frekuensi konjugasi yang tidak jauh berbeda, berkisar 10-6 hingga Waktu inkubasi yang lebih

18 lama memungkinkan terjadinya konjugasi lebih banyak, dan meningkatkan keberhasilan transfer putmini-tn5km1 yang mengandung mini-tn5 Km1 dari E. coli S17-1 (? pir) ke dalam sel B. japonicum. Frekuensi trans konjugasi BJ 38 pada waktu inkubasi 24 jam yang lebih rendah dibandingkan waktu inkubasi 18 jam dapat disebabkan oleh banyak hal diantaranya, kondisi donor yang mudah kehilangan pili pada waktu resuspensi resipien dengan donor. Pili merupakan bagian penting dari sel donor yang berperan sebagai jalur transfer transposon (DNA) dari sel donor ke sel resipien (Willetts 1988). Perbedaan frekuensi konjugasi antara B. japonicum KDR 15, BJ 11 dengan BJ 38 juga dapat disebabkan oleh perbedaan galur B. japonicum yang digunakan. Berdasarkan Sari (1998), walaupun di antara galur galur B. japonicum terdapat ciri fisiologi yang sama namun secara genotip berbeda, hal ini didasarkan analisis profil DNA B. japonicum denngan teknik pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Wahyudi et al. (1998) yang juga melakukan proses konjugasi pada B. japonicum BJ 11 mendapatkan frekuensi transkonjugasi sebesar 3.6 x Frekuensi transkonjugasi ini didapatkan dengan melakukan proses konjugasi menggunakan perbandingan konsentrasi sel E. coli 17-1 (? pir) dengan B. japonicum sebesar 1:10. Pada penelitian ini digunakan perbandingan E. coli S 17-1 (? pir) dengan B. japonicum sebesar 1:1, dan memperlihatkan frekuensi transkonjugasi yang lebih besar. Hal ini memperlihatkan bahwa perbandingan donor dengan resipiennya mempengaruhi hasil konjugasi. Perbedaan frekuensi transkonjugasi baik antar galur B. japonicum maupun waktu inkubasi mating, juga dapat disebabkan keberhasilan transposisi yang dipengaruhi oleh DNA polimerase I, faktor terminasi transkripsi (Rho) dan protein serupa histon (Berg 1989). Menurut Braam et al. (1999) frekuensi transposisi juga ditentukan oleh aktivitas gen tnp yang menyandikan enzim transposase (53 kda; 476 aa) yang berperan dalam proses eksisi transposon dari plasmid pembawanya. Proses mutagenesis dengan menggunakan transposon mini-tn5 Km1 yang dibawa oleh plasmid merupakan metode mutagenesis yang telah cukup banyak digunakan. Konstruksi mutan dilakukan dengan metode yang disebut cut and paste (Bhasin et al. 1999). Gen pir yang berada pada kromosom E. coli S 17-1 (? pir) merupakan gen yang berperan dalam replikasi plasmid put mini-tn5 Km1 ketika plasmid tersebut berada dalam sel donor. Ketiadaan gen tersebut pada genom resipien membuat plasmid tidak stabil dan transposonnya akan meloncat, sedangkan plasmid pembawanya (put) akan bunuh diri (suicide). Plasmid jenis ini umumnya disebut dengan suicide plasmid (Snyder & Champness 2003). Keberadan gen tra pada kromosom sel donor dan gen mob yang ada pada plasmid memungkinkan proses transfer plasmid dari sel donor ke sel resipien. Plasmid put mini-tn5km1 merupakan kelompok plasmid RP4 yang memiliki kisaran inang luas (Herrero et al. 1990), hal ini merupakan salah satu alasan penggunaan plasmid ini pada penelitian ini. Frekuensi transkonjugasi pada B. japonicum ini dapat dikatakan cukup tinggi dibandingkan Fodor et al. (2001) yang juga menggunakan Tn5 untuk melakukan mutagenesis pada bakteri fotosintesis ungu sulfur, Thiocapsa roseopersicina dan mendapatkan frekuensi konjugasi sebesar 10-8 (inkubasi konjugasi selama semalam). Frekuensi transposisi Tn5 pada R. meliloti hasil penelitian Simon et al. (1983) menunjukkan frekuensi yang lebih besar yakni 1 x Frekuensi transposisi yang hampir sama terlihat dari data hasil transposisi Tn5 pada R. japonicum sebesar 1 x 10-6 oleh Rostas et al. (1984). Penyisipan mini -Tn5 Km1 pada B. japonicum KDR 15, BJ 11 dan BJ 38 terjadi pada DNA kromosom, hal ini karena ketiga galur B. japonicum tersebut tidak memiliki plasmid indigenus (Sari 1998). Gen yang berperan dalam sifat toleransi asam-al pada B. japonicum tersebut akan lebih stabil jika dibandingkan apabila gen tersebut terdapat dalam plasmid. Beberapa galur BBA memiliki gen-gen yang berperan dalam nodulasi maupun pengikatan N 2 yang berada dalam plasmid maupun megaplasmid. Ketiadaan plasmid pada galur-galur B. japonicum yang ditelaah ini akan memudahkan analisis genetika molekulernya. Selain itu penyisipan mini- Tn5 Km1 akan lebih bersifat stabil karena menyisip pada DNA kromosom. Seleksi Mutan Seleksi diawali dengan mereplika hasil sebar B. japonicum hasil mating pada pada media YMA + MK % + Rif 50 µg/ml + Km 50 µg/ml Hanya sel B. japonicum yang tersisipi mini-tn5 Km1 saja yang mampu tumbuh pada media tersebut.

19 Keberadaan gen penyandi resistensi pada mini-tn5 Km1 menyebabkan B. japonicum mutan memiliki kemampuan resistensi terhadap kanamisin. Hasil replika ini kemudian dijadikan master plate untuk koloni B. japonicum yang diuji ke media Ayanaba. Koloni B. japonicum yang tidak mampu tumbuh pada media Ayanaba yang dipilih untuk diuji lebih lanjut. Ketidakmampuan sel B. japonicum tumbuh pada media Ayanaba, diduga disebabkan oleh rusaknya gen yang berperan dalam sifat toleransi asam-al akibat tersisipi transposon mini-tn5 Km1. Konjugasi dengan menggunakan mini-tn5 Km1 bersifat stabil. Hal ini disebabkan adanya gen tnp* penyadi enzim transposase pada plasmid put mini -Tn5Km1 berada diluar transposon, sehingga setelah terjadi transposisi, transposon tersebut tidak mampu melakukan transposisi atau meloncat lagi (Herrero et al. 1990). Oleh karena itu sifat resisten terhadap kanamisin juga akan stabil berada dalam genom B. japonicum walaupun mutan ini ditumbuhkan pada berbagai macam media. Komposisi lipopolisakarida, struktur luar membran, ekslusi proton (Chen et al. 1991, 1993), akumulasi senyawa poliamin selular (Fujihara & Yoneyama 1993) dan sintesa acid shock protein (Hickey & Hirshfield 1990) merupakan beberapa faktor yang mempengaruhi pertumbuhan sel pada ph asam. Flis et al. (1992) juga menyatakan beberapa fungsi fisiologis untuk ketahanan rhizobia terhadap Al di antaranya ialah pengikatan ion Al 3+ oleh eksopolisakarida untuk meminimalisasi toksisitas Al. Kerusakan pada gen yang berperan pada fungsi fisiologis tersebut dapat menyebabkan sel tidak mampu lagi toleran terhadap asam-al. Lebih jauh Aarons & Graham ( 1991) menelaah pengaruh cekaman asam pada R. leguminosarum bv. Phaseoli, dan didapatkan hasil, bahwa konsentrasi ion potasium sitoplasmik dan glutamat akan tinggi jika BBA tersebut ditumbuhkan pada medium asam. Dari penelitian Goss et al. (1990) didapatkan empat mutan sensitif asam R. meliloti WSM419 dengan menggunakan Tn5 sebagai transposon melalui proses triparental mating dari konsentrasi sel R. meliloti 10 8 CFU/mL. Goss et al. (1990) juga melakukan proses mutagenesis dengan transposon Tn5 terhadap BBA toleran asam Rhizobium meliloti WSM419. Kerusakan pada gen yang bertanggung jawab terhadap sifat toleran asam yakni gen act (acid tolerance) akibat penyisipan Tn5 akan menyebabkan terhambatnya pertumbuhan dan pengaturan ph internal sel (phi) pada R. meliloti jika ditumbuhkan pada media asam (ph: 5.6). Amplifikasi DNA Genom Pengapit Transposon dengan Inverse PCR Isolasi genom dilakukan dengan met ode CTAB karena metode ini cukup efektif dilakukan untuk isolasi DNA genom bakteri gram negatif. Pada tahapan ini mutan diinkubasi pada inkubator bergoyang (140 rpm) selama 5 hari, pada suhu ruang. Inkubasi dilakukan selama 5 hari karena B. japonicum merupakan jenis rhizobia tumbuh lambat, yang akan mencapai fase log setelah diinkubasi pada kisaran waktu 4-5 hari. Menurut hasil penelitian Sari (1998), B. japonicum KDR 15, BJ 38 dan BJ 11 tidak memiliki plasmid oleh karena itu genom yang diisolasi hanya genom kromosom. Hal ini dapat dipastikan gen yang bertanggung jawab terhadap sifat toleransi asam-al berada dalam kromosom, keadaan ini lebih memudahkan analisis, karena gen akan lebih stabil berada dalam kromosom dibandingkan dalam plasmid. DNA genom B. japonicum USDA 110 memiliki ukuran sekitar 8.7 Mb (Tomkins et al. 2001), dan diperkirakan ukuran genom B. japonicum yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kisaran ukuran genom yang sama. Genom hasil isolasi kemudian dipotong dengan menggunakan enzim restriksi EcoRV. Enzim ini akan memotong DNA diluar daerah transposon, sehingga sifat resistensi terhadap kanamisin tidak rusak, karena gen resistensi ini akan dijadikan template annealing primer spesifik yang akan digunakan pada proses inverse PCR. Dengan menggunakan enzim T4 DNA ligase kemudian dilakukan self ligation pada fragmen DNA hasil pemotongan EcoRV menghasilkan lingkaran monomerik. Self ligation pada potongan DNA yang mengandung transposon akan digunakan sebagai DNA template untuk proses inverse PCR. Proses self ligation merupakan tahap penting dalam proses inverse PCR, karena jika tidak terbentuk lingkaran monomerik ini maka tidak akan terjadi proses amplifikasi dengan arah amplifikasi keluar dari masingmasing primer. DNA sirkuler monomerik hasil self ligation kemudian diamplifikasi dengan teknik inverse PCR. Produk amplifikasi ialah fragmen DNA utas ganda linier yang mengandung ujung 5 P dan 3 OH yang sekuennya diketahui dan pada daerah tengah

20 mengandung situs pemotongan enzim EcoRV. Hasil inverse PCR sebesar 0.8 kb kemungkinan besar belum mengindikasikan keseluruhan gen yang berperan dalam sifat toleransi asam-al. Hal ini disebabkan oleh kemungkinan adanya sistem operon yang berperan dalam sifat toleransi ini. Namun hasil inverse PCR ini merupakan bukti kuat keberadaan gen toleransi asam-al pada B. japonicum galur BJ 11, karena dengan adanya penyisipan mini-tn5 Km1 pada daerah genom tersebut menyebabkan terganggunya sistem fisiologis yang berperan dalam sifat toleransi B. japonicum khususnya galur BJ 11. Studi genetik pada sel rhizobia toleran asam memperk irakan sedikitnya dua lokus dari megaplasmid atau kromosom untuk gen pengatur ph yang diperlukan dalam pertumbuhan rhizobia pada ph rendah (Chen et al. 1991; 1993). Pada R. loti, sifat toleran ph rendah berhubungan dengan komposisi dan struktur membran. Pada galur R. loti yang toleran asam terdapat satu protein membran dengan ukuran 49.5 kda dan tiga protein terlarut dengan ukuran 66.0, 85.0, dan 44.0 kda yang menunjukkan peningkatan ekspresi protein ketika sel tumbuh pada ph 4.0. Sifat toleran R. loti pada kondisi asam diperkirakan melibatkan mekanisme konstitutif seperti permeabilitas membran luar dengan respon adaptif termasuk fase pertumbuhan sel dan perubahan ekspresi protein (Correa & Borneix 1997). Ricillo et al. (2000) melakukan mutagenesis dengan transposon Tn5 untuk menelaah fragmen DNA genom R. tropici yang terlibat dalam sifat toleransi ph. Fragmen DNA sebesar 0.9 kb yang didapatkan ternyata memiliki homologi dengan enzim glutation sintetase dari E. coli. Hal ini mengindikasikan adanya peranan enzim glutation sintetase dalam mekanisme toleransi R. topici. Ukuran DNA yang didapatkan dari proses inverse PCR ini dapat saja berbeda jika pemotongan genom B. japonicum dilakukan oleh enzim restriksi selain EcoRV. Seperti hasil penelitian Goss et al. (1990) yang mengkarakterisasi mutan sensitif asam R. meliloti WSM419 dan mendapatkan fragmen genom yang dipotong oleh enzim EcoRI berukuran 4.4 kb, sebagai daerah flanking Tn5. Kerusakan pada daerah genom ini menyebabkan mutan tidak memiliki kemampuan untuk mengatur ph internal mendekati netral ketika ph eksternal kurang dari atau sama dengan 6. Wahyudi (2004) juga melakukan proses inverse PCR pada bakteri magnet Magnetospirillum magneticum untuk mengamplifikasi daerah flanking transposon mini Tn5. Daerah flanking yang berhasil diamplifikasi berukuran masing-masing 4.2 kb dan 2.8 kb untuk M. magneticum NMA 15 dan 17 yang didigesti dengan menggunakan enzim restriksi EcoRV. Kloning Fragmen DNA Genom Pengapit Transposon Plasmid rekombinan hasil ligasi antara vektor pgemt-easy dengan DNA sisipan merupakan alat penting untuk telaah molekuler lebih lanjut. Plasmid rekombinan yang ditransformasi ke dalam sel E. coli DH5a ini dimaksudkan untuk pembentukan klon, yaitu sel-sel individu yang mengandung molekul DNA rekombinan yang dapat dipropagasi dan disimpan untuk memproduksi molekul DNA rekombinan dalam jumlah besar sehingga dapat digunakan untuk mempelajari karakter fisiologis tertentu ataupun untuk mengkonservasi molekul DNA rekombinan dalam keadaan stabil (Dawson et al. 1996). Penyisipan DNA insert pada vektor pgemt-easy terjadi pada multiple cloning site (MCS) situs enzim EcoRV yang berada pada gen LacZ. Penyisipan pada gen ini memungkinkan seleksi transforman dengan metode koloni biru -putih. Warna koloni putih menunjukkan tidak adanya pemecahan senyawa X-gal akibat tidak adanya a- komplementasi antara plasmid rekombinan dengan sel inang dalam pembentukan enzim ß-galactosidase. Pemecahan senyawa X-gal akan mengubah warna koloni menjadi biru (Turner et al. 1997) Hasil verifikasi dua plasmid rekombinan yang dipotong dengan enzim EcoRI, masing-masing menunjukkan pola pita DNA yang sama, yakni pita DNA berukuran 3 kb (pgemt-easy) dan 0.8 kb (DNA sisipan). Hal ini menunjukkan proses kloning DNA sisipan dalam vektor pgemt- Easy ke sel E. coli DH 5a telah berhasil dilakukan. SIMPULAN Frekuensi konjugasi rata-rata terbesar untuk galur BJ 11 dan KDR 15 terjadi pada waktu inkubasi 24 jam, sedangkan untuk Bj 38 terjadi pada waktu inkubasi 18 jam Frekuensi konjugasi rata-rata untuk B. japonicum KDR 15, BJ 38 dan BJ 11 berturut-turut sebesar 4.9 x 10-6, 3.0 x 10-6, dan 2.9 x Fragmen DNA genom (~0.8 kb) yang terlibat dalam toleransi asam-al pada B.

21 japonicum BJ 11 telah berhasil diamplifikasi dengan inverse PCR dan diklon ke dalam plasmid pgemt-easy (~3 kb) membentuk plasmid rekombinan, pgemt-11 yang berukuran ~3.8 kb. SARAN Sebaiknya dilakukan karakterisasi dan analisis gen lebih lanjut dari fragmen DNA pengapit transposon (DNA flanking) mutan B. japonicum sensitif asam-al yang telah didapatkan dari penelitian ini. Beberapa hal yang perlu dilakukan ialah melakukan sekuensing DNA flanking dan karakterisasi protein yang berperan dalam toleransi asam -Al. DAFTAR PUSTAKA Aarons SR, Graham PH Response of Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli to acidity. Plant Soil 134: Ariyani F, Tedja-Imas, Wahyudi AT Transfer gen InaZ pada beberapa galur B. japonicum toleran asam dan aluminium. Hayati 6: Autret N, Dubail I, Trieu-Cuot P, Berche P, Charbit A Identification of new genes involved in the virulence of Listeria monocytogenes by signature-t agged transposon mutagenesis. Infect Immun 4: Ayanaba A, Asanuma S, Munns DN An Agar plaete method for rapid screening of Rhizobium for tolerance to acid-aluminium stress. Soil Sci Soc Am J 47: Berg DE, Berg CM The prokaryotic transposable element Tn5. Biotechnol 1: Berg DE Transposon Tn5. Di dalam Berg DE, Howe MM (editor). Mobile DNA. Washington: Washington Press. hlm Bhasin A, Goryshin IY, Reznikoff WS Hairpin formation in Tn5 transposition. J Biol Chem 274: Braam LAM, Goryshin IY, Reznikoff WS A Mechanism for Tn5 Inhibition carboxyl-terminal dimerization. J Biol Chem 274: Bruijn FJ, Lupski JR The use of transposon Tn 5mutagenesis in the rapid generation of correlated physical and geneticalmaps of DNA segments cloned into multicopy plasmids. A review. Gene 27: Chen H, Gartner E, Rolfe BG Involvement of genes on a megaplasmid in the acid-tolerant phenotype of Rhizobium leguminosarum biovar trifolii. Appl Environ Microbiol 59: [Abstrak]. Chen H, Richardson AE, Rolfe BG Studies on the physiological and genetic basis of acid tolerance in Rhizobium leguminosarum biovar trifolii. Appl Environ Microbiol 59: [Abstrak]. Correa OS, Barneix AJ Cellular mechanisms of ph tolerance in Rhizobium loti. World J Microbiol Biotechnol 13: Dawson MT, Powell R, Gannon F Gene Technology. Graham JM, Billington D, Gilmartin PM, editor. Oxford: BIOS Scientific Publ. Ltd. hlm De Lorenzo V, Herrero M, Jakubzik U, Timmis KN Mini -Tn5 Transposon derivatives for insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal insertion of cloned DNA in gram negative eubacteria. J Bacteriol 172: Endarini T. Wahyudi AT, Imas T Seleksi galur-galur Bradyrhizobium japonicum indigenus toleran medium asam-al. Hayati 2: Firon A, Villalba F, Beffa R, d Enfert C Ident ification of essential genes in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus by transposon mutagenesis. Eucariot Cell 2 :

22 Flis SE, Glenn AR, Dilworth MJ The interaction between aluminium and root nodule bacteria. Soil Biol Biochem 25: Fodor B, Rakhely G, Kovacs AT, Kovacs KL Transposon mutagenesis in purple sulfur photosynthetic bacteria: identification of hypf, encoding a protein capable of processing [NiFe] hydrogenases in a ß and? subdivisions of the proteobacteria. Appl Environ Microbiol 6: Fujihara S, Yoneyama T Effects of ph and osmotic stress on cellular polyamine contents in the soybean rhizobia Rhizobium fredii p220 and Bradyrhizobium japonicum A Appl Environ Microbiol 59: [Abstrak]. Goryshin IY,Reznikoff WS Tn5 in vitro transposition. J Biol Chem 273: Goss TJ, O Hara GW, Dilworth MJ, Glenn AR Cloning, characterization, and complementation of lesions causing acid sensitivity in Tn5-induced mutants of Rhizobium meliloti WSM419. J Bacteriol 9: Herrero M, de Lorenzo V, Timmis KN Transposon vectors containing nonantibiotic resistance selestion markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram negative bacteria. J bacteriol 172: Hickey EW, Hirshfield IN Low -phinduced effects on patterns of protein synthesis and on internal ph in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Appl Environ Microbiol 56: Huang G, Zhang L, Birch RG Rapid amplification and cloning of Tn5 flanking fragments by inverse PCR. Lett Appl Microbiol 31: Johnson AC,Wood M DNA, a possible site of action of aluminum in Rhizobium spp. Appl Environ Microbiol 56: Jordan DC Rhizobiaceae. Di dalam Krieg NR dan Holt JE, editor. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology Vol 1. Baltimore: The Williams & Wilkin Co. hlm Keyser HH, Munns DN Tolerance of Rhizobia to acidity, aluminum and phospate. Soil Sci Soc Am J 43: O Hara GW, Thomas JG, Michael JD, Andrew RG Maintenance of intracelluler ph and acid tolerance in Rhizobium meliloti. Appl Environ Microbiol 55: Rao NSS Soil Microorganisms and Plant Growth. Ed ke-3. New Hampshire: Science Publishers Inc. Ricillo PM et al Glutathione in involved in environmental stress responses in Rhizobium tropici, including acid tolerance. J Bacteriol 182: Richardson AE, Simpson RJ, Djordjevic MA, Rolfe BJ Expression of nodulation genes in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii is affected by low ph and by Ca 2+ and Al ions. Appl Environ Microbiol 54: Rostas K, Sista DS, Stanley J, Verma DPS Transposon mutagenesis of Rhiz obium japonicum. Mol Gen Genet 197: Sakinah, Tedja-Imas, Achmadi SS Aktivitas ekstrak kasar enzim protokatekuat 3,4 dioksigenase dari beberapa galur B. japonicum. Hayati 2: Sambrook W, Russel DW Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Vol 1. Ed ke-3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Sari N Aspek fisiologi dan analisis DNA genom beberapa galur Bradyrhizobium japonicum toleran asam-al [skripsi]. Bogor: Departemen Biologi, FMIPA-IPB.

23 Simon R, Priefer U, Puhler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: Transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Bio/Technology 1: Somasegaran P, Hoben HJ Handbook of Rhizobia. Methods in Legume Rhizobium Technology. New York: Springer-Verlag. Snyder L, Champness W Molecular Genetics of Bacteria. Washington DC: ASM Press. Wahyudi AT Genome-wide screening of genes involved in magnetite synthesis in magnetic bacterium Magnetospirillum magneticum AMB-1 using transposon mutagenesis [D isertasi]. Tokyo: Tokyo University of Agriculture and Technology. Willetts N Conjugation. Di dalam Grinsted J, Bennett PM, editor. Plasmid Technology. London: Academic Press. hlm Tedja-Imas, Wahyudi AT, Tjahjoleksono A, Saraswati R Seleksi galur -galur bakteri bintil akar kedelai unggul pada cekaman ph rendah dan kekeringan. Laporan Penelitian. Pengembangan riset terpadu LIPI PAU Bioteknologi IPB. Bogor. Tomkins JP et al A marker-dense physical map of the Bradyrhizobium japonicum Genome. Genome Research 11: Turner PC, Mc Lennan, Bates AD, White MRH Instant Notes in Molecular Biology. Washington: BIOS Scientific. Voelker LL, Dybvig K Transposon mutagenesis. Methods Mol Biol 104: Wahyudi AT Seleksi Galur -galur Bradyrhizobium japonicum toleran asamaluminium:analisi gen gen penanda molekuler dan kompetisi in planta [tesis]. Bogor: Departemen Biologi, FMIPA-IPB. Wahyudi AT, Suwanto A, Tedja-Imas T, Tjahjoleksono A Screening of acidaluminium tolerant Bradyrhizobium japonicum strains: analysis of marker genes and competition in planta. Aspac J Mol Biol Biotechnol 6 : Wahyudi AT, Matsunaga T, Takeyama H Isolation of Magnetospirillum magneticum AMB-1 Mutants Defective in Bacterial Magnetic Particle Synthesis by Transposon Mutagenesis. Appl Biochem Biotechnol 91-93:

24 LAMPIRAN

25 Lampiran 1. Skema pros es mutagenesis dengan transposon Km r pili Km s Km s E. coli S 17-1 (? pir) B. japonicum Media LA modifikasi Keterangan: Proses mutagenesis dengan transposon. Konjugasi dilakukan di atas filter milipore (0.45 µm) pada media LA modifikasi. Pada suspensi campuran donor (D) dengan resipien (R) akan terjadi serangkaian proses transfer dan penyisipan transposon. Sel E. coli S17-1 (? pir) (D) akan membentuk pili (mating pair formation) terhadap sel B. japonicum (R) sebagai jalur transfer plasmid put mini-tn5km1. Kemudian pada sel B. japonicum, dengan segera akan terinduksi kerja enzim transposase yang berperan dalam proses eksisi transposon mini-tn5km1 yang terdapat dalam putmini-tn5km1 dan menyisipkannya ke dalam genom B. japonicum. putminitn5km1 merupakan tipe plasmid bunuh diri (suicide plasmid) yang akan terdegradasi jika pada sel inang tidak ada aktivitas gen pir. Dari serangkaian proses tersebut maka akan didapatkan sel B. japonicum yang memiliki sifat resisten terhadap kanamisin (Km r ) dari sel B. japonicum yang sebelumnya sensitif kanamisin (Km s ) akibat tersisipi transposon.

Pembuatan Media Kultur Bakteri Pemanenan sel bakteri. Isolasi DNA kromosom bakteri. Kloning DNA

Pembuatan Media Kultur Bakteri Pemanenan sel bakteri. Isolasi DNA kromosom bakteri. Kloning DNA LAMPIRAN 15 15 Lampiran 1 Tahapan penelitian Pembuatan Media Kultur Bakteri Pemanenan sel bakteri Isolasi DNA kromosom bakteri Pemotongan DNA dengan enzim restriksi Kloning DNA Isolasi DNA plasmid hasil

Lebih terperinci

KLONING FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM

KLONING FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM PKMI-1-04-1 KLONING FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM Rika Indri Astuti, Dewi Monasari, Sarah Asih Faulina Departemen Biologi, Fakultas MIPA,

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN. Jenis penelitian yang dilakukan termasuk dalam penelitian dasar yang. dilakukan dengan metode deskriptif (Nazir, 1998).

BAB III METODE PENELITIAN. Jenis penelitian yang dilakukan termasuk dalam penelitian dasar yang. dilakukan dengan metode deskriptif (Nazir, 1998). BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan termasuk dalam penelitian dasar yang dilakukan dengan metode deskriptif (Nazir, 1998). B. Populasi dan Sampel 1. Populasi yang

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode deskriptif (Nazir, 1983). B. Populasi dan Sampel Populasi dalam penelitian ini adalah

Lebih terperinci

HASIL. Tabel 1 Pertumbuhan galur B. japonicum dan E. coli pada media agar yang mengandung antibiotik

HASIL. Tabel 1 Pertumbuhan galur B. japonicum dan E. coli pada media agar yang mengandung antibiotik HASIL Penentuan Resistensi terhadap Antibiotik Ketiga galur B. japonicum BJ11, BJ38, dan KDR15 menunjukkan kemampuannya tumbuh pada media YMA CR 0.0025% yang mengandung antibiotik ampisilin, rifampisin

Lebih terperinci

TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Bintil Akar

TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Bintil Akar TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Bintil Akar Salah satu interaksi bakteri dengan tanaman yang paling penting dan menarik adalah antara tanaman legum dan bakteri dari genus Rhizobium, Bradyrhizobium, Shinorhizobium,

Lebih terperinci

ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA Bradyrhizobium japonicum DINI NURDIANI

ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA Bradyrhizobium japonicum DINI NURDIANI ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA Bradyrhizobium japonicum DINI NURDIANI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

Lebih terperinci

BAHAN DAN METODE. Tempat dan Waktu Penelitian

BAHAN DAN METODE. Tempat dan Waktu Penelitian BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Kerjasama Bioteknologi Indonesia- Belanda (BIORIN) dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST), Pusat

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian deskriptif. Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode B. Objek Penelitian Objek penelitian ini adalah sampel DNA koleksi hasil

Lebih terperinci

BAHAN DAN METODE. Hrp -, IAA +, BPF Hrp -, IAA + + , BPF Hrp. , BPF Hrp -, IAA +, BPF + Hrp. , BPF Hrp. , BPF Hrp. Penambat Nitrogen Penambat Nitrogen

BAHAN DAN METODE. Hrp -, IAA +, BPF Hrp -, IAA + + , BPF Hrp. , BPF Hrp -, IAA +, BPF + Hrp. , BPF Hrp. , BPF Hrp. Penambat Nitrogen Penambat Nitrogen BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB dan lahan pertanian Kampung Bongkor, Desa Situgede, Karang Pawitan-Wanaraja,

Lebih terperinci

BAB 3 PERCOBAAN. Alat elektroforesis agarosa (Biorad), autoklaf, cawan Petri, GeneAid High Speed Plasmid

BAB 3 PERCOBAAN. Alat elektroforesis agarosa (Biorad), autoklaf, cawan Petri, GeneAid High Speed Plasmid BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Alat Alat elektroforesis agarosa (Biorad), autoklaf, cawan Petri, GeneAid High Speed Plasmid Mini kit, inkubator goyang (GSL), jarum Ose bundar, kit GFX (GE Healthcare), kompor listrik

Lebih terperinci

Kloning Domain KS dan Domain A ke dalam Sel E. coli DH5α. Analisis Bioinformatika. HASIL Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri

Kloning Domain KS dan Domain A ke dalam Sel E. coli DH5α. Analisis Bioinformatika. HASIL Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri 3 selama 1 menit, dan elongasi pada suhu 72 0 C selama 1 menit. Tahap terakhir dilakukan pada suhu 72 0 C selama 10 menit. Produk PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1 % (b/v) menggunakan tegangan 70

Lebih terperinci

3. METODE PENELITIAN

3. METODE PENELITIAN 19 3. METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai Juni 2010 di Laboratorium Mikrobiologi, Biokimia dan Bioteknologi Hasil Perairan Departemen Teknologi Hasil

Lebih terperinci

BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN

BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN Sebelum melakukan PCR, terlebih dahulu dilakukan perancangan primer menggunakan program DNA Star. Pemilihan primer dilakukan dengan mempertimbangkan parameter spesifisitas,

Lebih terperinci

LAMPIRAN. Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer

LAMPIRAN. Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer LAMPIRAN Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer A. LARUTAN STOK CTAB 5 % (100 ml) - Ditimbang NaCl sebanyak 2.0 gram - Ditimbang CTAB sebanyak 5.0 gram. - Dimasukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian murni yang dilakukan dengan metode deskriptif, yaitu suatu metode penelitian untuk membuat deskripsi, gambaran atau lukisan

Lebih terperinci

BAHAN DAN METODE. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli 2007 sampai bulan Juni 2008 di

BAHAN DAN METODE. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli 2007 sampai bulan Juni 2008 di BAHAN DAN METODE : Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli 2007 sampai bulan Juni 2008 di 1. Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB IPB 2. Laboratorium Mikrobiologi

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan 7 sampel dari 7

BAB III METODE PENELITIAN. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan 7 sampel dari 7 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan 7 sampel dari 7 individu udang Jari yang diambil dari Segara Anakan Kabupaten Cilacap Jawa Tengah.

Lebih terperinci

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Bahan Pertumbuhan dan Peremajaan Isolat Pengamatan Morfologi Isolat B. thuringiensis

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Bahan Pertumbuhan dan Peremajaan Isolat Pengamatan Morfologi Isolat B. thuringiensis 13 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, IPB, dari bulan Oktober 2011 Mei 2012. Bahan Isolasi untuk memperoleh isolat B. thuringiensis

Lebih terperinci

ANALISA HASIL TRANSFORMASI DENGAN MENGGUNAKAN PCR KOLONI DAN RESTRIKSI

ANALISA HASIL TRANSFORMASI DENGAN MENGGUNAKAN PCR KOLONI DAN RESTRIKSI 1 ANALISA HASIL TRANSFORMASI DENGAN MENGGUNAKAN PCR KOLONI DAN RESTRIKSI PENDAHULUAN Polimerase Chain Reaction (PCR) PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu

Lebih terperinci

HASIL DAN PEMBAHASAN

HASIL DAN PEMBAHASAN HSIL DN PEMBHSN R. pickettii sebagai gen Hayati R. solani Isolat yang digunakan adalah R. pickettii yang memiliki ciri-ciri koloni berwarna kuning dengan bentuk bundar dengan tepian licin dan elevasi seperti

Lebih terperinci

Gambar 1. Struktur organisasi promoter pada organisme prokariot [Sumber: University of Miami 2008: 1.]

Gambar 1. Struktur organisasi promoter pada organisme prokariot [Sumber: University of Miami 2008: 1.] Gambar 1. Struktur organisasi promoter pada organisme prokariot [Sumber: University of Miami 2008: 1.] Gambar 2. Struktur organisasi promoter pada organisme eukariot [Sumber: Gilbert 1997: 1.] Gambar 3.

Lebih terperinci

BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Bahan 3.2 Alat

BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Bahan 3.2 Alat BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Bahan Bahan yang digunakan memiliki kualitas pro analisis atau pro biologi molekular, yaitu : primer M. tuberculosis forward: 5 GGATCCGATGAGCAAGCTGATCGAA3 (Proligo) dan primer M. tuberculosis

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian ini adalah penelitian deskriptif yang mengangkat fenomena alam sebagai salah satu masalah dalam penelitian. Penelitian ini dapat menerangkan

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN. Dalam penelitian ini dilakukan lima tahap utama yang meliputi tahap

BAB III METODE PENELITIAN. Dalam penelitian ini dilakukan lima tahap utama yang meliputi tahap BAB III METODE PENELITIAN Dalam penelitian ini dilakukan lima tahap utama yang meliputi tahap penyiapan templat mtdna, amplifikasi fragmen mtdna pada daerah D-loop mtdna manusia dengan teknik PCR, deteksi

Lebih terperinci

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN. Pengambilan sampel. Penyiapan templat mtdna dengan metode lisis sel

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN. Pengambilan sampel. Penyiapan templat mtdna dengan metode lisis sel 16 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN Bab ini menggambarkan tahapan penelitian yang terdiri dari pengambilan sampel, penyiapan templat mtdna dengan metode lisis sel, amplifikasi D-loop mtdna dengan teknik

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN 39 BAB III METODE PENELITIAN A. Desain Penelitian Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian deskriptif. Penelitian membuat deskripsi secara sistematis, faktual dan akurat mengenai fakta-fakta dan

Lebih terperinci

III. BAHAN DAN METODE

III. BAHAN DAN METODE III. BAHAN DAN METODE 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB. Biogen)

Lebih terperinci

BAB IX. DASAR-DASAR TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

BAB IX. DASAR-DASAR TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN BAB IX. DASAR-DASAR TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Di dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan beserta tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi isolasi DNA kromosom

Lebih terperinci

FAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI

FAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI ISOLASI TOTAL DNA TUMBUHAN DENGAN KIT EKSTRAKSI DNA PHYTOPURE Halaman : 1 dari 5 1. RUANG LINGKUP Metode ini digunakan untuk mengisolasi DNA dari sampel jaringan tumbuhan, dapat dari daun, akar, batang,

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN Bagan Alir Penelitian ini secara umum dapat digambarkan pada skema berikut:

BAB III METODE PENELITIAN Bagan Alir Penelitian ini secara umum dapat digambarkan pada skema berikut: BAB III METODE PENELITIAN Tahapan-tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah: pengumpulan sampel, lisis terhadap sampel mtdna yang telah diperoleh, amplifikasi daerah HVI mtdna sampel dengan menggunakan

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN. amplifikasi daerah HVI mtdna sampel dengan menggunakan teknik PCR;

BAB III METODE PENELITIAN. amplifikasi daerah HVI mtdna sampel dengan menggunakan teknik PCR; BAB III METODE PENELITIAN Secara garis besar, langkah-langkah yang dilakukan dalam penelitian ini adalah: pengumpulan sampel; lisis terhadap sampel mtdna yang telah diperoleh; amplifikasi daerah HVI mtdna

Lebih terperinci

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli 2012 sampai bulan Desember 2012 di

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli 2012 sampai bulan Desember 2012 di 23 III. METODOLOGI PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli 2012 sampai bulan Desember 2012 di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis penelitian Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian dasar dengan metode deskriptif (Nazir, 1988). B. Populasi dan sampel Populasi pada penelitian ini adalah

Lebih terperinci

SINTESIS DAN PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat (TRANSAKTIVATOR) HIV-1 KE DALAM VEKTOR EKSPRESI PROKARIOT pqe-80l EKAWATI BETTY PRATIWI

SINTESIS DAN PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat (TRANSAKTIVATOR) HIV-1 KE DALAM VEKTOR EKSPRESI PROKARIOT pqe-80l EKAWATI BETTY PRATIWI SINTESIS DAN PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat (TRANSAKTIVATOR) HIV-1 KE DALAM VEKTOR EKSPRESI PROKARIOT pqe-80l EKAWATI BETTY PRATIWI 0304040257 UNIVERSITAS INDONESIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN

Lebih terperinci

Asam Asetat Glacial = 5,7 ml EDTA 0,5 M ph 8.0 = 10 ml Aquades ditambahkan hingga volume larutan 100 ml

Asam Asetat Glacial = 5,7 ml EDTA 0,5 M ph 8.0 = 10 ml Aquades ditambahkan hingga volume larutan 100 ml 36 Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer A. Pembuatan Larutan Stok Tris HCL 1 M ph 8.0 (100 ml) : Timbang Tris sebanyak 12,114 g. Masukkan Tris ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades.

Lebih terperinci

III. BAHAN DAN METODE

III. BAHAN DAN METODE III. BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesian - The Netherlands) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Penelitian

Lebih terperinci

TUGAS TERSTRUKTUR BIOTEKNOLOGI PERTANIAN VEKTOR DNA

TUGAS TERSTRUKTUR BIOTEKNOLOGI PERTANIAN VEKTOR DNA TUGAS TERSTRUKTUR BIOTEKNOLOGI PERTANIAN VEKTOR DNA Oleh: Gregorius Widodo Adhi Prasetyo A2A015009 KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN PROGRAM

Lebih terperinci

FAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI

FAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI Halaman : 1 dari 5 ISOLASI TOTAL DNA HEWAN DENGAN KIT EKSTRAKSI DNA 1. RUANG LINGKUP Metode ini digunakan untuk mengisolasi DNA dari sampel jaringan hewan, dapat dari insang, otot, darah atau jaringan

Lebih terperinci

Di dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan. beserta tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi

Di dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan. beserta tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi Di dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan beserta tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi isolasi DNA kromosom dan DNA vektor, pemotongan DNA menggunakan

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN. Secara garis besar langkah-langkah yang dilakukan dalam penelitian ini

BAB III METODE PENELITIAN. Secara garis besar langkah-langkah yang dilakukan dalam penelitian ini BAB III METODE PENELITIAN Secara garis besar langkah-langkah yang dilakukan dalam penelitian ini adalah: pengumpulan sampel; lisis terhadap sampel mtdna yang telah diperoleh; amplifikasi daerah D-loop

Lebih terperinci

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN MENENGAH DIREKTORAT PEMBINAAN SEKOLAH MENENGAH ATAS

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN MENENGAH DIREKTORAT PEMBINAAN SEKOLAH MENENGAH ATAS KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN MENENGAH DIREKTORAT PEMBINAAN SEKOLAH MENENGAH ATAS Test Seleksi Calon Peserta International Biology Olympiad (IBO) 2014 2 8 September

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN. Penelitian ini merupakan penelitian yang dilakukan dengan metode

BAB III METODE PENELITIAN. Penelitian ini merupakan penelitian yang dilakukan dengan metode 16 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian yang dilakukan dengan metode deskriptif. Penelitian deskriptif adalah suatu metode penelitian untuk membuat deskripsi,

Lebih terperinci

BAHAN DAN METODE. Produksi Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan (rgh)

BAHAN DAN METODE. Produksi Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan (rgh) 11 BAHAN DAN METODE Penelitian ini terdiri atas 2 tahapan utama, yaitu produksi protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) dari ikan kerapu kertang, ikan gurame, dan ikan mas, dan uji bioaktivitas protein

Lebih terperinci

III. BAHAN DAN METODE

III. BAHAN DAN METODE III. BAHAN DAN METODE 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan dari bulan November 2006 sampai dengan Januari 2008. Penelitian bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi,

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis penelitian Jenis penelitian ini adalah penelitian deskriptif yang mengangkat fenomena alam sebagai salah satu masalah dalam penelitian, sehingga dapat menerangkan arti

Lebih terperinci

BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN

BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN 14 BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN Konfirmasi bakteri C. violaceum dan B. cereus dilakukan dengan pewarnaan Gram, identifikasi morfologi sel bakteri, sekuensing PCR 16s rdna dan uji kualitatif aktivitas

Lebih terperinci

BAB in. METODE PENELITIAN

BAB in. METODE PENELITIAN BAB in. METODE PENELITIAN Waktu Dan Tempat Penelitian Penelitian ini telah dilakukan dari April sampai November 2009 di laboratorium Biologi Molekular dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi

Lebih terperinci

HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi DNA Genomik Sengon

HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi DNA Genomik Sengon HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi DNA Genomik Sengon DNA genomik sengon diisolasi dari daun muda pohon sengon. Hasil uji integritas DNA metode 1, metode 2 dan metode 3 pada gel agarose dapat dilihat pada Gambar

Lebih terperinci

PETUNJUK PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER Oleh: Ixora Sartika M ISOLASI DNA PLASMID

PETUNJUK PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER Oleh: Ixora Sartika M ISOLASI DNA PLASMID PETUNJUK PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER Oleh: Ixora Sartika M ixomerc@uny.ac.id ISOLASI DNA PLASMID Plasmid adalah DNA ekstrakromosom yang berbentuk sirkuler dan berukuran kecil (1 200 kb). Sebagian

Lebih terperinci

LAMPIRAN. Lampiran 1. Deskripsi Pembuatan Larutan Stok dan Buffer

LAMPIRAN. Lampiran 1. Deskripsi Pembuatan Larutan Stok dan Buffer LAMPIRAN Lampiran 1. Deskripsi Pembuatan Larutan Stok dan Buffer 1. Pembuatan Larutan Stok a. CTAB 5 % Larutan dibuat dengan melarutkan : - NaCl : 2.0 gr - CTAB : 5.0 gr - Aquades : 100 ml b. Tris HCl

Lebih terperinci

METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan pada bulan April 2012 sampai dengan bulan Juni 2012 di

METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan pada bulan April 2012 sampai dengan bulan Juni 2012 di III. METODOLOGI PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan April 2012 sampai dengan bulan Juni 2012 di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN 25 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian telah berlangsung sejak bulan Januari 2012 - Juli 2012 di Laboratorium Mikrobiologi, Lab. Optik, Lab. Genetika dan Lab. Biologi Molekuler Jurusan

Lebih terperinci

Gambar 2 Vektor pengklonan pgem T Easy

Gambar 2 Vektor pengklonan pgem T Easy BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September 2007 sampai dengan bulan April 2008. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Seluler Tanaman, dan Laboratorium

Lebih terperinci

III. METODE PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi

III. METODE PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi 17 III. METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung pada Januari

Lebih terperinci

3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat 3.2 Bahan dan Alat

3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat 3.2 Bahan dan Alat 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Autentikasi Bahan Baku Ikan Tuna (Thunnus sp.) dalam Rangka Peningkatan Keamanan Pangan dengan Metode Berbasis DNA dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan

Lebih terperinci

BAB 3 PERCOBAAN Mikroba C. violaceum, Bacillus cereus dan E. coli JM 109

BAB 3 PERCOBAAN Mikroba C. violaceum, Bacillus cereus dan E. coli JM 109 9 BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Alat, Bahan dan Miroba 3.1.1 Alat Bunsen, inkubator 37 o C, sentrifuga (Mikro 200R Hettich), Eppendorf 100 ul, 500 ul, 1,5 ml, tabung mikrosentrifuga (Eppendorf), neraca timbang (Mettler

Lebih terperinci

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode 24 BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode penelitian deskriptif. B. Objek Penelitian Empat spesies burung anggota Famili

Lebih terperinci

II. METODOLOGI PENELITIAN. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana,

II. METODOLOGI PENELITIAN. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana, II. METODOLOGI PENELITIAN 2.1. Metode Pengumpulan Data 2.1.1. Tempat dan waktu penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Lebih terperinci

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan dan Alat

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan dan Alat 12 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan dari bulan April 2006 sampai dengan bulan April 2007. Penelitian dilakukan di rumah kaca, laboratorium Biologi Molekuler Seluler Tanaman, dan

Lebih terperinci

HASIL DAN PEMBAHASAN

HASIL DAN PEMBAHASAN HASIL DAN PEMBAHASAN Pemotongan Parsial dan Penyisipan Nukleotida pada Ujung Fragmen DNA Konstruksi pustaka genom membutuhkan potongan DNA yang besar. Untuk mendapatkan fragmen-fragmen dengan ukuran relatif

Lebih terperinci

BAHAN DAN METODE. Ekstraksi Senyawa Antimikrob

BAHAN DAN METODE. Ekstraksi Senyawa Antimikrob BAHAN DAN METODE Mikrob yang Digunakan dalam Penelitian Tiga isolat bakteri simbion spons yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat HAL-13, HAL-74, dan HAA-01. Ketiga isolat tersebut merupakan

Lebih terperinci

VISUALISASI HASIL PCR DENGAN METODE PCR LANGSUNG DAN TIDAK LANGSUNG PADA SAMPEL BAKTERI Pseudomonas fluorescens dan Ralstonia solanacearum

VISUALISASI HASIL PCR DENGAN METODE PCR LANGSUNG DAN TIDAK LANGSUNG PADA SAMPEL BAKTERI Pseudomonas fluorescens dan Ralstonia solanacearum VISUALISASI HASIL PCR DENGAN METODE PCR LANGSUNG DAN TIDAK LANGSUNG PADA SAMPEL BAKTERI Pseudomonas fluorescens dan Ralstonia solanacearum Pendahuluan Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik

Lebih terperinci

EKSTRAKSI DNA. 13 Juni 2016

EKSTRAKSI DNA. 13 Juni 2016 EKSTRAKSI DNA 13 Juni 2016 Pendahuluan DNA: polimer untai ganda yg tersusun dari deoksiribonukleotida (dari basa purin atau pirimidin, gula pentosa,dan fosfat). Basa purin: A,G Basa pirimidin: C,T DNA

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Metode penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah deskriptif. Penelitian deskriptif bertujuan untuk membuat deskripsi, gambaran, atau lukisan secara

Lebih terperinci

METODE. A. Peremajaan Salmonella sp. B. Verifikasi Salmonella sp.

METODE. A. Peremajaan Salmonella sp. B. Verifikasi Salmonella sp. METODE Alur Penelitian Alur penelitian dan metode yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari 6 tahapan, yaitu: peremajaan bakteri Salmonella sp., verifikasi bakteri Salmonella sp., isolasi fage,

Lebih terperinci

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4. HASIL DAN PEMBAHASAN 29 4. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Karakteristik isolat bakteri dari ikan tuna dan cakalang 4.1.1 Morfologi isolat bakteri Secara alamiah, mikroba terdapat dalam bentuk campuran dari berbagai jenis. Untuk

Lebih terperinci

o C 1 menit, penempelan 50 o C 1 menit, polimerisasi 72 o C 1 menit (tiga tahap ini

o C 1 menit, penempelan 50 o C 1 menit, polimerisasi 72 o C 1 menit (tiga tahap ini 13 BAB IV PERCOBAAN IV.1 Bahan Air miliq, deoksinukleotida trifosfat (dntp), MgCl 2, (Promega), enzim Pfu DNA polymerase, dapar Pfu (Stratagene), oligonukleotida SR1, SR2, SR3, SR4, SR5, AR6, AR7, AR8,

Lebih terperinci

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode 22 BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode penelitian deskriptif. B. Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Lokasi Penelitian Penelitian

Lebih terperinci

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Bahan dan Alat Metode Penelitian Isolasi Aktinomiset

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Bahan dan Alat Metode Penelitian Isolasi Aktinomiset BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, dari bulan Februari sampai dengan

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN. Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah deskriptif.

BAB III METODE PENELITIAN. Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah deskriptif. BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah deskriptif. Penelitian deskriptif adalah metode penelitian yang bertujuan untuk membuat gambaran

Lebih terperinci

BAB III BAHAN DAN CARA KERJA. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat

BAB III BAHAN DAN CARA KERJA. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat BAB III BAHAN DAN CARA KERJA A. LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI, Cibinong selama 9 bulan (Maret 2008-- November 2008).

Lebih terperinci

bio.unsoed.ac.id METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian

bio.unsoed.ac.id METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian III. METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian 1.1. Peralatan Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol sampel, beaker glass, cool box, labu

Lebih terperinci

3. METODE PENELITIAN

3. METODE PENELITIAN 29 3. METODE PENELITIAN 3.1. Lokasi dan Waktu Penelitian Lokasi penelitian meliputi Laut Sulawesi, Selat Makassar, Teluk Bone, Laut Flores, Laut Banda, Teluk Tolo, Laut Maluku dan Teluk Tomini (Gambar

Lebih terperinci

METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Metode penelitian Isolasi RNA total

METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Metode penelitian Isolasi RNA total METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan mulai bulan Februari 2005 hingga bulan Maret 2008 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman dan Laboratorium BIORIN (Biotechnology

Lebih terperinci

HASIL. Bj 11 (wt) Bj 11 (19) Bj 11 (5) 6 mm 6 mm

HASIL. Bj 11 (wt) Bj 11 (19) Bj 11 (5) 6 mm 6 mm 15 HASIL Peremajaan Uji Seluruh galur uji tipe liar dan mutannya bercirikan khas bakteri bintil akar tumbuh lambat yaitu berbentuk bundar, elevasi cembung, berlendir, tembus cahaya, dan memiliki koloni

Lebih terperinci

BAB III METODE PENELITIAN. mengekstraksi DNA dari dari beberapa spesimen herbarium Rafflesia arnoldii

BAB III METODE PENELITIAN. mengekstraksi DNA dari dari beberapa spesimen herbarium Rafflesia arnoldii 21 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif kuantitatif untuk mengekstraksi DNA dari dari beberapa spesimen herbarium Rafflesia arnoldii R.Br dan Rafflesia

Lebih terperinci

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian akan diawali dengan preparasi alat dan bahan untuk sampling

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian akan diawali dengan preparasi alat dan bahan untuk sampling 16 BAB III METODOLOGI PENELITIAN Penelitian akan diawali dengan preparasi alat dan bahan untuk sampling sel folikel akar rambut. Sampel kemudian dilisis, diamplifikasi dan disekuensing dengan metode dideoksi

Lebih terperinci

BAB III METODE A. Jenis Penelitian B. Populasi dan Sampel C. Waktu dan Lokasi Penelitian D. Alat dan Bahan Rizki Indah Permata Sari,2014

BAB III METODE A. Jenis Penelitian B. Populasi dan Sampel C. Waktu dan Lokasi Penelitian D. Alat dan Bahan Rizki Indah Permata Sari,2014 34 BAB III METODE A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian murni atau pure research yang dilakukan dengan metode deskriptif, yaitu suatu metode penelitian untuk membuat deskripsi, gambaran

Lebih terperinci

HASIL DAN PEMBAHASAN bp bp bp

HASIL DAN PEMBAHASAN bp bp bp HASIL DAN PEBAHASAN Purifikasi dan Pengujian Produk PCR (Stilbena Sintase) Purifikasi ini menggunakan high pure plasmid isolation kit dari Invitrogen. Percobaan dilakukan sesuai dengan prosedur yang terdapat

Lebih terperinci

BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN. Oligonukleotida sintetis daerah pengkode IFNα2b sintetis dirancang menggunakan

BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN. Oligonukleotida sintetis daerah pengkode IFNα2b sintetis dirancang menggunakan BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN Oligonukleotida sintetis daerah pengkode IFNα2b sintetis dirancang menggunakan program komputer berdasarkan metode sintesis dua arah TBIO, dimana proses sintesis daerah

Lebih terperinci

4.1. Alat dan Bahan Penelitian a. Alat Penelitian. No. URAIAN ALAT. A. Pengambilan sampel

4.1. Alat dan Bahan Penelitian a. Alat Penelitian. No. URAIAN ALAT. A. Pengambilan sampel 7 IV. METODE PENELITIAN Ikan Lais diperoleh dari hasil penangkapan ikan oleh nelayan dari sungaisungai di Propinsi Riau yaitu S. Kampar dan S. Indragiri. Identifikasi jenis sampel dilakukan dengan menggunakan

Lebih terperinci

METODOLOGI. Gambar 1 Bahan tanaman : (a) Tetua IR64; (b) tetua Hawarabunar, dan (c) F 1 (IRxHawarabunar) c a b

METODOLOGI. Gambar 1 Bahan tanaman : (a) Tetua IR64; (b) tetua Hawarabunar, dan (c) F 1 (IRxHawarabunar) c a b METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan dua tahap yaitu penanaman padi dan analisis fisiologi dan marka molekuler. Penanaman padi secara gogo pada tanah masam dilakukan di rumah kaca Cikabayan

Lebih terperinci

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. A. SINTESIS DAN AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN tat HIV-1 MELALUI

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. A. SINTESIS DAN AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN tat HIV-1 MELALUI BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. SINTESIS DAN AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN tat HIV-1 MELALUI TEKNIK PCR OVERLAPPING 1. Sintesis dan amplifikasi fragmen ekson 1 dan 2 gen tat HIV-1 Visualisasi gel elektroforesis

Lebih terperinci

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. A. ISOLASI DNA GENOM PADI (Oryza sativa L.) KULTIVAR ROJOLELE,

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. A. ISOLASI DNA GENOM PADI (Oryza sativa L.) KULTIVAR ROJOLELE, BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. ISOLASI DNA GENOM PADI (Oryza sativa L.) KULTIVAR ROJOLELE, NIPPONBARE, DAN BATUTEGI Isolasi DNA genom padi dari organ daun padi (Oryza sativa L.) kultivar Rojolele, Nipponbare,

Lebih terperinci

METODE PENELITIAN. Penelitian ini telah dilakukan pada bulan Januari-Mei 2015 di Laboratorium

METODE PENELITIAN. Penelitian ini telah dilakukan pada bulan Januari-Mei 2015 di Laboratorium 15 III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian ini telah dilakukan pada bulan Januari-Mei 2015 di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas

Lebih terperinci

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4 HASIL DAN PEMBAHASAN 17 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Konstruksi plasmid biner pmsh1-lisozim Konstruksi plasmid biner dilakukan dengan meligasi gen lisozim ayam dan pmsh1. Plasmid hasil ligasi berukuran 13.449 pb (Gambar 5A kolom

Lebih terperinci

BAHAN DAN METODE. Bahan dan Alat

BAHAN DAN METODE. Bahan dan Alat BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah daun salam, daun jati belanda, daun jambu biji yang diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka (PSB) LPPM-IPB Bogor. Bahan yang digunakan untuk uji

Lebih terperinci

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Pada penelitian ini terdapat lima tahapan penelitian yang dilakukan yaitu

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Pada penelitian ini terdapat lima tahapan penelitian yang dilakukan yaitu BAB III METODOLOGI PENELITIAN Pada penelitian ini terdapat lima tahapan penelitian yang dilakukan yaitu pengumpulan sampel berupa akar rambut, ekstraksi mtdna melalui proses lisis akar rambut, amplifikasi

Lebih terperinci

LAPORAN II (ISOLASI DNA GENOM)

LAPORAN II (ISOLASI DNA GENOM) LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA LAPORAN II (ISOLASI DNA GENOM) KHAIRUL ANAM P051090031/BTK BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010 0 ISOLASI DNA GENOM TUJUAN 16s rrna. Praktikum

Lebih terperinci

I. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April - Juli 2012 di Laboratorium. Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

I. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April - Juli 2012 di Laboratorium. Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung. 1 I. METODOLOGI PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April - Juli 2012 di Laboratorium Biokimia, Laboratorium Instrumentasi Jurusan Kimia Fakultas Matematika

Lebih terperinci

BAB 4. METODE PENELITIAN

BAB 4. METODE PENELITIAN BAB 4. METODE PENELITIAN Penelitian penanda genetik spesifik dilakukan terhadap jenis-jenis ikan endemik sungai paparan banjir Riau yaitu dari Genus Kryptopterus dan Ompok. Penelitian ini bertujuan untuk

Lebih terperinci

Identifikasi Gen Abnormal Oleh : Nella ( )

Identifikasi Gen Abnormal Oleh : Nella ( ) Identifikasi Gen Abnormal Oleh : Nella (10.2011.185) Identifikasi gen abnormal Pemeriksaan kromosom DNA rekombinan PCR Kromosom waldeyer Kromonema : pita spiral yang tampak pada kromatid Kromomer : penebalan

Lebih terperinci

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Bahan dan Alat

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Bahan dan Alat 12 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Survei penyakit klorosis dan koleksi sampel tanaman tomat sakit dilakukan di sentra produksi tomat di daerah Cianjur, Cipanas, Lembang, dan Garut. Deteksi

Lebih terperinci

3 Metodologi Penelitian

3 Metodologi Penelitian 3 Metodologi Penelitian 3.1 Alat Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian Biokimia, Program Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung. Peralatan yang digunakan pada penelitian ini diantaranya

Lebih terperinci

TINJAUAN PUSTAKA Kedelai Toleran Asam Bakteri Bintil Akar

TINJAUAN PUSTAKA Kedelai Toleran Asam Bakteri Bintil Akar 3 TINJAUAN PUSTAKA Kedelai Toleran Asam Tanaman kedelai (Glycine max Linn. Merrill) tergolong subfamili Papilionoideae, famili Leguminosae. Tanaman dalam subfamili ini umumnya mempunyai kemampuan bersimbiosis

Lebih terperinci

II. MATERI DAN METODE. Tempat pengambilan sampel daun jati (Tectona grandis Linn. f.) dilakukan di

II. MATERI DAN METODE. Tempat pengambilan sampel daun jati (Tectona grandis Linn. f.) dilakukan di II. MATERI DAN METODE 2.1 Waktu dan Tempat Penelitian Tempat pengambilan sampel daun jati (Tectona grandis Linn. f.) dilakukan di enam desa yaitu tiga desa di Kecamatan Grokgak dan tiga desa di Kecamatan

Lebih terperinci

BAB II. BAHAN DAN METODE

BAB II. BAHAN DAN METODE BAB II. BAHAN DAN METODE 2.1 Kultur Bakteri Pembawa Vaksin Bakteri Escherichia coli pembawa vaksin DNA (Nuryati, 2010) dikultur dengan cara menginokulasi satu koloni bakteri media LB tripton dengan penambahan

Lebih terperinci

Pengertian TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN. Cloning DNA. Proses rekayasa genetik pada prokariot. Pemuliaan tanaman konvensional: TeknologiDNA rekombinan:

Pengertian TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN. Cloning DNA. Proses rekayasa genetik pada prokariot. Pemuliaan tanaman konvensional: TeknologiDNA rekombinan: Materi Kuliah Bioteknologi Pertanian Prodi Agroteknologi Pertemuan Ke 9-10 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Ir. Sri Sumarsih, MP. Email: Sumarsih_03@yahoo.com Weblog: Sumarsih07.wordpress.com Website: agriculture.upnyk.ac.id

Lebih terperinci

BAHAN DAN METODE. ditranskipsi dan produk translasi yang dikode oleh gen (Nasution 1999).

BAHAN DAN METODE. ditranskipsi dan produk translasi yang dikode oleh gen (Nasution 1999). 4 ditranskipsi dan produk translasi yang dikode oleh gen (Nasution 1999). Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu

Lebih terperinci