OBSERVASI KUALITAS SEMEN CAIR SAPI PERANAKAN ONGOLE TERHADAP PERBEDAAN WAKTU INKUBASI PADA PROSES PEMISAHAN SPERMATOZOA

Transkripsi

1 OBSERVASI KUALITAS SEMEN CAIR SAPI PERANAKAN ONGOLE TERHADAP PERBEDAAN WAKTU INKUBASI PADA PROSES PEMISAHAN SPERMATOZOA (Observation of Chilled Semen Quality of the Ongole Crossbred Cattle at Different Incubation Time in Sperm Separation Process) WULAN CAHYA PRATIWI 1, L. AFFANDHY 1 dan P. SITUMORANG 2 1 Loka Penelitian Sapi Potong, Jl. Pahlawan No. 2, Grati, Pasuruan Balai Penelitian Ternak, PO Box 221, Bogor ABSTRACT The purpose of this study is to find out the effect of incubation time before sperm separation process on the quality of chilled semen of sexing sperm. This study was conducted at Beef Cattle Station Research Laboratory, Grati, Pasuruan. Sexing was done with Albumin Column as media of separation and egg yolk tris aminomethane as diluter. The Ongole Grade Cattle bull was used as semen provider. Data collected were ph, motility, live sperm, sperm abnormality. The results showed that sperm quality at each incubation treatment (20, 25, 30 minutes with 10 replications) were not significantly different. The quality of stored sperm decreased in six days. Motility and life sperm decreased arround and 15.7% for upper fraction and 22.8 and 20.0% for lower fraction. The abnormality of sperm at upper and lower fractions increased 0.8 and 0.9% respectively. The mean of ph was 7.5. Overall results showed there is no effect of different incubation time in sperm quality. Key Word: Cattle, Chilled Semen, Incubation, Upper Fraction, Lower Fraction ABSTRAK Optimalisasi teknologi Inseminasi Buatan diantaranya mengupayakan sapi induk melahirkan pedet setiap tahun dengan jenis kelamin sesuai harapan. Tujuan Penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh waktu inkubasi terhadap kualitas semen cair sexing yang disimpan selama 6 hari. Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei Juli 2006 di Laboratorium Lolit Sapo, Grati, Pasuruan. Metode pemisahan menggunakan gradien putih telur dengan pengencer semen tris amino methane-kuning telur. Sebagai sumber semen adalah pejantan sapi PO, umur 4 tahun, bobot badan 530 kg. Data yang diamati meliputi: ph, motilitas, sperma hidup, abnormalitas. Penelitian ini menggunakan RAL tiga perlakuan (lama inkubasi 20, 25, 30 menit) 10 ulangan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kualitas semen pada ketiga perlakuan inkubasi tidak berbeda dengan kecenderungan menurun sampai penyimpanan hari ke-6. Penurunan motilitas dan sperma hidup masingmasing sebesar 22,75 dan 15,7% (fraksi atas); 22,8 dan 20,0% (fraksi bawah). Abnormalitas spermatozoa pada fraksi atas dan bawah meningkat masing-masing sebesar 0,8 dan 0,9%. ph semen pada kedua fraksi adalah 7,5. Disimpulkan bahwa lama inkubasi yang berbeda tidak mempengaruhi kualitas semen. Kata Kunci: Sapi, Semen Cair, Inkubasi, Fraksi Atas, Fraksi Bawah PENDAHULUAN Peningkatan produktivitas sapi potong membutuhkan teknologi perbaikan tatalaksana efisiensi reproduksi. Namun dalam usaha ternak sapi potong rakyat masih mengalami beberapa permasalahan; diantaranya adalah menurunnya produktivitas dan populasi ternak. Penurunan tersebut dapat disebabkan oleh faktor manajemen dan perkawinan yang belum tepat yang akan berdampak terhadap lambatnya umur beranak pertama, rendahnya angka konsepsi (S/C >2) serta panjangnya jarak beranak (> 15 bulan) (PAMUNGKAS et al., 2004). Oleh karena itu diperlukan teknologi alternatif untuk mengatasi permasalahan reproduksi tersebut, diantaranya perbaikan kualitas pejantan dan performa induk yang 195

2 diikuti dengan perbaikan proses pembuatan semen dan tatalaksana perkawinan serta penyediaan pakan yang cukup sehingga akan meningkatkan efisiensi reproduksi dan akan berdampak meningkatkan produktivitas pada sapi potong. Pada tahun 2004 dan 2005 telah dilakukan penelitian aplikasi inseminasi spermatozoa X dan Y pada sapi induk PO pada kondisi peternak dengan menggunakan semen cair memperoleh hasil CR pada straw X mencapai 42,9% dan straw Y mencapai 56,3% dengan posisi IB pada pertengahan cornua uteri/4+ (PAMUNGKAS et al., 2004) dan ketepatan fraksi atas pada spermatozoa X sebesar 53% dan spermatozoa Y sebesar 47% (AFFANDHY et al., 2005). Menurut GARNER dan SEIDEL (2000) menyatakan bahwa tingkat keberhasilan teknologi pemisahan spermatozoa XY mencapai 85 95%, namun hasil penelitian SUSILAWATI (2002) melaporkan bahwa penggunaan putih telur cukup efektif sebagai bahan pemisahan spermatozoa XY dengan menghasilkan spermatozoa Y proporsi bawah sebesar 75,8 ± 13% demikian pula hasil pemisahan spermatozoa dengan menggunakan gradient putih telur yang di IB-kan pada sapi PO memperoleh kebuntingan 40% (SUSILAWATI, 2002). Hasil penelitian KAIIN et al. (2004) menyatakan bahwa motilitas spermatozoa X 45% dan Y 40% sehingga layak digunakan untuk proses semen beku dengan bahan pengencer yang baik adalah pengencer tris dan kuning telur (GUNAWAN et al., 2004; ANGGRAENY et al., 2004). Program Inseminasi Buatan di usaha ternak sapi potong rakyat di Jatim, Jateng, DIY dan Bali menunjukkan bahwa > 50% peternak masih menghendaki program IB dilanjutkan; namun permasalahannya masih terjadinya kawin berulang kali (AFFANDHY et al., 2005), sehingga akan berpengaruh terhadap tingkat keberhasilan kebuntingan dan jarak beranak. Tingkat kebuntingan juga dipengaruhi oleh faktor nutrisi (WARDHANI et al., 1993; WALKER et al., 1994), body condition dan nilai post thawing motility (PTM) (BOOTHEY et al., 1995; HAFEZ et al., 2000), sedangkan nilai PTM tersebut dapat dipengaruhi oleh ketersediaan N2 cair (SELK et al., 2002; SAID et al., 2004), maupun suhu (ekuilibrasi) selama proses pembuatan semen (FOOTE et al., 2002; AFIATI et al., 2004). Hasil survei eksistensi IB di wilayah sentra bibit menunjukkan bahwa perlu dilakukan perbaikan terhadap infrastruktur IB sedangkan di wilayah pengembangan dibutuhkan perbaikan teknis dalam pelaksanaan IB (AFFANDHY et al., 2005). Suksesnya pelaksanaan IB banyak dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti pada saat penampungan, proses pembuatan semen, ketepatan deteksi birahi, teknik inseminasi, waktu inseminasi, disposisi semen, manajemen pemeliharaan dan manajemen pakan (ARIFIN et al., 2001). Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh perbedaan lama inkubasi (waktu pemisahan spermatozoa X dan Y) sebelum proses pemisahan spermatozoa terhadap kualitas semen cair hasil sexing. MATERI DAN METODE Penelitian ini dilakukan di laboratorium dan kandang percobaan Loka Penelitian Sapi Potong, Grati, Pasuruan pada bulan Mei Juli Materi yang digunakan adalah satu ekor pejantan Sapi Peranakan Ongole yang berumur 4 tahun dengan bobot badan 530 kg. Bahan pengencer semen yang digunakan dalam penelitian ini adalah Tris aminomethanekuning telur dengan perbandingan antara pengencer dan semen adalah 2 : 3. Media pemisahan spermatozoa yang digunakan adalah putih telur (Albumin Column). Penelitian ini menggunakan tiga perlakuan inkubasi (waktu pemisahan) yang berbeda yaitu 20, 25 dan 30 menit dengan 10 ulangan. Prosedur penelitian Sebelum dilakukan proses pemisahan spermatozoa terlebih dahulu dilakukan penampungan semen dengan menggunakan vagina buatan. Kemudian dilanjutkan dengan pemeriksaan kualitas semen segar yang meliputi volume, warna, konsistensi, ph, gerakan massa, motilitas, persentase spermatozoa hidup, konsentrasi spermatozoa. Selanjutnya dilakukan proses pemisahan spermatozoa sebagai berikut: 1. Membuat larutan putih telur dengan konsentrasi 30% dan 10%. 2. Memasukkan larutan putih telur (konsentrasi 30% dan 10%) masing-masing 196

3 sebanyak 2 ml ke dalam tabung reaksi (dimulai dari konsentrasi 30% kemudian 10%, secara perlahan melalui dinding tabung. 3. Membuat larutan pengencer tris aminomethan dengan cara timbang 3,028 g trisaminomethan ke dalam 100 ml aquades ke dalam erlenmeyer dan diaduk kemudian ditambahkan 1,675 g asam sitrat dan 1,250 g fruktosa; selanjutnya ditambahkan antibioik (penicillin dan streptomycin). 4. Membuat bahan pengencer Trisaminomethan kuning telur 10% dengan komposisi kuning telur 10 ml dan trisaminomethan 90 ml sehingga volume total tetap 100 ml. 5. Membuat pengenceran semen dengan perbandingan pengencer dan semen 2 : Semen yang telah diencerkan dimasukkan sebanyak 2 ml ke dalam tabung yang berisi 2 lapisan putih telur melalui dinding tabung; lalu diinkubasikan (waktu pemisahan spermatozoa X dan Y) selama 20, 25, dan 30 menit pada suhu kamar. 7. Pengambilan lapisan bagian atas sebanyak 2 ml; lapisan bagian bawah sebanyak 2 ml; masing-masing dimasukkan dalam tabung yang berisi 3 ml pengencer. 8. Memasukkan tabung yang berisi lapisan atas dan bawah ke dalam sentrifus dan diputar selama 5 menit dengan kecepatan 1500 rpm. 9. Supernatannya dibuang sebanyak 3 ml dan disisakan 2 ml kemudian diuji kualitasnya. 10. Penyimpanan hasil sexing dilakukan secara bertahap dengan mengatur suhu pada 33 C, kemudian suhu diturunkan sampai 15 C, 10 C dan akhirnya sampai suhu 5 C (pada tiap-tiap penurunan suhu tersebut dilakukan penambahan pengencer secara bertahap). Pengamatan terhadap kualitas semen hasil sexing dilakukan pada penyimpanan hari ke-1 dan hari ke-6. Parameter yang diamati adalah kuantitas (volume per ejakulat) dan kualitas semen segar serta kualitas semen cair hasil sexing yang meliputi ph, motilitas, viabilitas. Data yang diperoleh diolah dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga perlakuan inkubasi (waktu pemisahan) yaitu 20, 25, 30 menit dimana setiap perlakuan dengan 10 ulangan. HASIL DAN PEMBAHASAN Kualitas semen segar Sebelum dilakukan proses pemisahan spermatozoa yang dilanjutkan dengan pembuatan semen cair,maka terlebih dahulu dilakukan evaluasi terhadap kualitas semen segar. Tabel 1 menunjukkan hasil evaluasi semen segar pejantan sapi potong sebelum diproses untuk semen cair sexing. Tabel 1. Rataan volume dan kualitas semen segar pejantan sapi potong PO Parameter Kualitas semen segar Konsistensi Kental Konsentrasi spermatozoa 1160,0 ± 56,57 (juta/cc) Gerakan Massa +++ ph 7,0 Motilitas (%) 85 Spermatozoa hidup (%) 97 Spermatozoa mati (%) 2 Spermatozoa abnormal (%) 1 Tampak bahwa semen segar tersebut mempunyai nilai gerakan massa +++, konsentrasi spermatozoa 1160,0 ± 56,57 juta/ml spermatozoa, ph 7, spermatozoa hidup 97% dan volume semen mencapai 7,8 ± 1,6 ml/ejakulasi. Pada penelitian ini rataan volume semen lebih tinggi dibandingkan dengan kondisi peternakan rakyat (6,1 ± 0,2 ml/ejakulasi) (AFFANDHY et al., 2003). Adanya perbedaan volume semen pada tiap ejakulasi antara lain dapat dipengaruhi oleh kualitas pakan, suhu lingkungan dan dewasa kelamin dari seekor pejantan. Standar/patokan Lolit Sapi Potong terhadap kualitas semen yang dapat diproses lebih lanjut dalam satu ejakulasi adalah semen tersebut mempunyai gerak massa minimal ++; dimana ciri-ciri gerakan cepat seperti mendung yang berputar (TOELIHERE, 1993). Menurut AFFANDHY et al. (2004) untuk pembuatan semen cair standar yang harus dipenuhi adalah gerakan massa ++ sampai dengan +++, motilitas > 70%, konsentrasi sperma > 750 juta/ml ejakulat dengan konsistensi sedang sampai dengan kental dan warna putih 197

4 kekuningan hingga krem (AFFANDHY et al., 2004). Dengan demikian dapat dinyatakan bahwa rataan kualitas semen segar pejantan sapi PO yang digunakan sebagai materi percobaan adalah baik dan layak untuk diproses lebih lanjut karena berada di atas persyaratan minimal sebagai semen yang digunakan untuk proses sexing semen cair. Proses inkubasi spermatozoa dan kualitas spermatozoa hasil sexing Proses inkubasi adalah suatu proses yang dilakukan untuk memberi kesempatan kepada spermatozoa X dan Y untuk melakukan penetrasi pada lapisan putih telur. Hal ini didasari oleh adanya perbedaan motilitas spermatozoa X dan Y yang disebabkan oleh perbedaan massa dan ukurannya (SUSILAWATI, 2001). Ukuran spermatozoa Y yang lebih kecil sehingga bergerak lebih cepat atau mempunyai daya penetrasi yang lebih tinggi untuk memasuki suatu larutan (SUSILAWATI, 2001). Spermatozoa Y akan bergerak ke bawah sedang spermatozoa X tetap di lapisan atas (HAFEZ et al., 2000). Kualitas semen cair hasil sexing pada lapisan atas (spermatozoa X) dan lapisan bawah (spermatozoa Y) dengan waktu inkubasi yang berbeda disajikan pada Tabel 2. Tabel 2 menunjukkan bahwa perbedaan lama inkubasi (waktu pemisahan spermatozoa) selama 20, 25 dan 30 menit tidak menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap kualitas semen (motilitas, sperma hidup, dan sperma abnormal) baik pada lapisan atas maupun bawah pada saat setelah sentrifugasi maupun pada pengamatan hari ke- 1 sampai hari ke-6. Hal ini disebabkan karena perbedaan interval waktu yang kecil pada masing-masing perlakuan yaitu lima menit; sehingga tidak terjadi perubahan yang signifikan terhadap kualitas spermatozoa pada ketiga perlakuan inkubasi tersebut. Walaupun demikian persentase motilitas, sperma hidup dan abnormal menunjukkan perbedaan yang nyata antara penyimpanan hari ke-1 dan hari ke-6. Persentase motilitas dan sperma hidup menunjukkan penurunan dari penyimpanan hari ke-1 sampai dengan hari ke-6, sementara itu persentase sperma abnormal mengalami peningkatan. Pada lapisan atas (X) menunjukkan motilitas semen pada penyimpanan hari ke-1 pada waktu inkubasi yang berbeda berkisar antara 75 76,5%. Pada penyimpanan hari ke-6, motilitas sperma mengalami penurunan sebesar 8,5 28,2%, yaitu berkisar antara 47,8 51,0%. Begitu pula dengan persentase sperma hidup juga mengalami penurunan sebesar 10,7 17%, yaitu dari 79,9 83,3% (hari ke-1) menjadi 66,3 69,2% (hari ke-6). Sementara itu persentase sperma abnormal mengalami peningkatan sebesar 0,5 0,8%, yaitu dari 0,9 1,9% (hari ke-1) menjadi 1,7 2,4% (hari ke-6) (Tabel 2). Tabel 2. Rataan kualitas semen cair hasil sexing spermatozoa lapisan atas (X) dan lapisan bawah (Y) pada pejantan sapi potong PO di Lolit Sapi Potong, Grati, Pasuruan Kualitas semen cair lap. atas (X) Kualitas semen cair lap. bawah (Y) Parameter 1 hari 6 hari 1 hari 6 hari A B C A B C A B C A B C ph 7,5 a* 7,5 a 7,5 a 7,5 p 7,5 p 7,5 p 7,5 a 7,5 a 7,5 a 7,5 p 7,5 p 7,5 p Motilitas (%) 75 a 76,5 a 76,5 a 66,5 p 48,3 p 51,0 p 76,0 a 77,5 a 76,0 a 48,0 p 52,2 p 48,0 p Sperma hidup (%) Sperma abnormal (%) 83,3 a 81,8 a 79,9 a 66,3 p 69,2 p 68,7 p 83,0 a 85,9 a 78,4 a 65,7 p 67,8 p 61,1 p 0,9 a 1,1 a 1,9 a 2,4 p 2,3 p 1,7 p 1,8 a 1,6 a 1,2 a 0,7 p 1,6 p 2,2 p *huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata (p > 0,05) A: waku pemisahan 20 menit; B: waktu pemisahan 25 menit; C: waktu pemisahan 30 menit 198

5 Keadaan pada lapisan bawah (spermatozoa Y) tidak jauh berbeda dengan lapisan atas (spermatozoa X). Pada lapisan bawah menunjukkan rataan kualitas semen segar dan cair hasil sexing spermatozoa lapisan bawah (Y). Tidak terdapat perbedaan yang nyata pada kualitas semen (motilitas, persentase sperma hidup dan abnormal) dengan waktu inkubasi (pengeraman) yang berbeda yaitu 20, 25, 30 menit pada penyimpanan hari ke-1 sampai dengan hari ke-6. Seperti halnya lapisan atas (X), pada lapisan bawah (Y) terjadi penurunan motilitas sperma dari penyimpanan hari ke-1 (76 77,5%) sampai dengan hari ke-6 (48 52,2%). Penurunan juga terjadi pada persentase sperma hidup dari 78,4 85,9% (hari ke-1) sampai 61,1 65,7% (hari ke-6). Demikian pula untuk persentase sperma abnormal mengalami kenaikan dari penyimpanan hari ke-1 (1,3 1,8%) sampai dengan hari ke-6 (0,7 2,2%) (Tabel 2). Walaupun demikian persentase motilitasnya pada penyimpanan hari ke-6 masih lebih besar dari 40% yaitu berkisar antara 48,0% pada lapisan bawah (spermatozoa Y) dan 66,5% pada lapisan atas (spermatozoa X) (Tabel 2). Keadaan penyimpanan dalam jangka waktu yang lama menyebabkan penurunan kualitas spermatozoa akibat adanya asam laktat hasil proses metabolisme sel yang menyebabkan kondisi medium menjadi semakin asam. Kondisi ini dapat bersifat racun terhadap spermatozoa yang akhirnya menyebabkan kematian sperma (SUGIARI et al., 2004). Tidak terdapatnya perbedaan yang nyata pada kualitas spermatozoa pada waktu inkubasi yang berbeda disebabkan oleh selisih waktu yang kecil antar perlakuan inkubasi sehingga tidak mempengaruhi kualitas spermatozoa selama proses. Walaupun terjadi penurunan untuk semua kualitas semen sexing dalam kemasan semen cair pada hari ke-6, tetapi motilitasnya masih dalam batas normal, yaitu > 40%; sehingga masih layak untuk diinseminasikan pada induk sapi potong (KAIIN et al., 2004). KESIMPULAN Dari hasil penelitian di atas dapat disimpulkan bahwa perbedaan lama waktu inkubasi tidak mempengaruhi kualitas semen cair hasil sexing. Semen cair hasil sexing yang disimpan selama 6 hari menunjukkan penurunan kualitas (motilitas, hidup sperma dan abnormalitas) dari kondisi segar. Namun penurunannya itu masih di atas batas normal dan layak untuk diinseminasikan pada sapi induk. DAFTAR PUSTAKA AFFANDHY, L., D. PAMUNGKAS. HARTATI, P.W. PRIHANDINI, P. SITUMORANG dan T. SUSILAWATI Peningkatan Produktivitas Sapi Potong melalui Efisiensi Reproduksi: Laporan Penelitian. Loka Penelitian Sapi Potong, Grati, Pasuruan. AFFANDHY, L., D. PAMUNGKAS, MARIYONO dan P. SITUMORANG Efisiensi penggunaan semen cair melalui suplementasi mineral Zn dan Vitamin E pada sapi potong: Laporan Penelitian. Loka Penelitian Sapi Potong, Grati, Pasuruan. AFFANDHY, L., P. SITUMORANG, P.W. PRIHANDINI dan D.B. WIJONO Performans reproduksi dan pengelolaan sapi potong induk pada kondisi peternakan rakyat. Pros. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor, September Puslitbang Peternakan, Bogor. hlm AFIATI, F., E.M. KAIIN, M. GUNAWAN, S. SAID dan B. TAPPA Perbaikan teknik pembekuan spermatozoa: Pengaruh suhu gliserolisasi penggunaan kaset straw. Pros. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor, 4 5 Agustus Puslitbang Peternakan, Bogor. hlm ANGGRAENY, Y.N., L. AFFANDHY dan A. RASYID Efektifitas subsitusi pengencer tris-sitrat dan kolesterol menggunakan air kelapa dan kuning telur terhadap kualitas semen beku sapi potong. Pros. Seminar Nasional. Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor, 4 5 Agustus Puslitbang Peternakan, Bogor. hlm ARIFIN, M. dan E. RIANTO Profile produktivitas sapi Peranakan Ongole pada peternakan rakyat: Studi kasus di kabupaten Grobogan, Jawa Tengah. J. Trop. Anim. Dev. Special Edition (April). hlm BOOTHEY, D. and G. FANEY A Practical Guide Artificial Breeding of Cattle. Agmedia, East Melbourne Vic p FOOTE, R.H. and M.T. KAPROTH Large batch freezing of bull semen: effect of time of freezing and fructose on fertility. J. Dairy Sci. 85:

6 GARNER, D.L. and G.E. SEIDEL Sexing Bull Sperm. Animal Reproduction and Biotechnology laboratory. Colorado State Univ. Foothillis Research Campus, Fort Collins, Colorado, USA. GUNAWAN, M., F. AFIATI, E.M KAIIN, S. SAID dan B. TAPPA Pengaruh medium pengencer terhadap kualitas spermatozoa beku sapi PO. Pros. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor, 4 5 Agustus Puslitbang Peternakan, Bogor. hlm HAFEZ, E.S.E Reproduction in Farm Animals. 7 th Edition. Reproductive Health Center. IVF Andrology Laboratory. Kiawah Island, South Carolina, USA. pp 509. KAIIN, E.M., M. GUNAWAN, S. SAID dan B. TAPPA Fertilisasi dan perkembangan oosit hasil IVF dengan sperma hasil pemisahan. Pros. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor, 4 5 Agustus Puslitbang Peternakan, Bogor. hlm PAMUNGKAS, D., L.. AFFANDHY, A. RASYID, D.B. WIJONO dan T. SUSILOWATI Teknologi Pemisahan Spermatozoa Sapi Potong. Laporan Penelitian. Loka Penelitian Sapi Potong, Grati, Pasuruan. SAID, S., E.M. KAIIN, F. AFIATI, M. GUNAWAN dan B. TAPPA Perbaikan teknik pembekuan: pengaruh ketinggian straw dan penggunaan rak dinamis. Pros. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor, 4 5 Agustus Puslitbang Peternakan, Bogor. hlm SELK, G Artificial Insemination for Beef Cattle. (12 Januari 2006). SUGIARTI, T., E. TRIWULANNINGSIH, P. SITUMORANG, R.G. SIANTURI dan D.A. KUSUMANINGRUM Penggunaan katalase dalam produksi semen dingin sapi. Pros. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor, 4 5 Agustus. Puslitbang Peternakan, Bogor. hlm SUSILAWATI, T Pembekuan Spermatozoa Sapi Limousin Hasil Sexing dengan Gradient Konsentrasi Putih Telur. Laporan Penelitian. Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya, Malang. SUSILAWATI, T Tingkat Keberhasilan Inseminasi Buatan pada Sapi Peranakan Ongole Menggunakan Hasil Sexing dengan Gradient Konsentrasi Putih Telur. Laporan Penelitian. Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya, Malang. TOELIHERE, M.R Inseminasi Buatan pada Ternak. Penerbit Angkasa, Bandung. WALKER, D., H. RITCHIE and D. HAWKINS Effective Use of Artificial Insemination in Beef Cattle. Michigan State Univ. Extension. MSU Exention Beef Bull.: , 01/01/94 (Cook@msue.msu.edu.). WARDHANI, N.K., A. MUSOFIE, U. UMIYASIH, L. AFFANDHY, M.A. YUSRAN dan D.B. WIJONO Pengaruh perbaikan gizi terhadap kemampuan reproduksi sapi Madura. Pros. Pertemuan Ilmiah Hasil Penelitian dan Pengembangan Sapi Madura. Grati, Pasuruan. hlm