Kata Kunci : Pengembangan metoda, UPLC, HPLC, Obat batuk cair.

Transkripsi

1 PENGEMBANGAN METODE ANALISIS DEXTROMETHORPHAN HBr DAN DIPHENHYDRAMIN HCl DALAM SEDIAAN OBAT BATUK CAIR MENGGUNAKAN ULTRA PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPH (UPLC) Muhamad Faisal Fuad, Dra. Eka Herlina M.Pd, Drs. Agus Taufiq M.Si Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pakuan Bogor. Abstrak. Pengembangan metode analisis dilakukan seiring tuntutan waktu analisis yang semakin cepat, terutama pada industri yang menutut kecepatan dengan biaya seminimal mungkin. Penulis mencoba mengembangkan metode analisis Dextromethophan Hbr dan Diphenhydramin HCl dalam sediaan obat batuk cair dari menggunakan High performance Liquid Chromatograph (HPLC) menjadi menggunakan Ultra performance Liquid chromatograph (UPLC). Pada penelitian sebelumnya untuk penetapan vitamin B1, B2, dan B6 pada suatu minuman suplemen multivitamin menggunakan HPLC pada tekanan < 4000 psi membutuhkan waktu 15 menit dengan metoda fase gerak gradien, dan hanya membutuhkan waktu 3 menit jika menggunakan UPLC pada tekanan 4000 Psi Psi. Sehingga diharapkan dengan pengembangan metoda ini ke UPLC akan didapatkan run time (waktu injeksi) yang jauh lebih singkat. Penelitian ini bertujuan mendapatkan metode yang lebih cepat dan lebih efisien untuk metode analisis Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramin HCl dengan pemanfaatan UPLC. Metode penelitian yang dilakukan terdiri dari pencarian laju alir yang optimum, verifikasi, dan pengolahan data. Pencarian laju alir yang optimum dilakukan dengan membandingkan parameter kesesuaian sistemnya yang meliputi resolusi (daya pisah), simpangan baku relatif (RSD), dan tailing factor (faktor pengekoran) pada laju alir 0.20, 0.30, dan 0.40 ml/menit. Verifikasi yang dilakukan meliputi presisi, akurasi, dan selektivitas. Berdasarkan hasil uji kesesuaian sistem didapatkan laju alir yang optimal pada kecepatan 0.30 ml/menit dengan waktu retensi Dextromethorphan HBr menit dan untuk Diphenhydramine HCl menit yang sebelumnya pada HPLC Dextromethorphan HBr menit dan Diphenhydramine HCl menit. Setelah diverifikasi didapat hasil yang memenuhi persyaratan uji verifikasi yaitu dengan resolusi dengan persyaratan > 1.5, simpangan baku relatif (RSD) 0.50% untuk Dextromethorphan HBr, 0.55% untuk Diphenhydramin HCl dengan persyaratan < 2.0%, dan recovery 99,97% untuk Dextromethorphan HBr, % untuk Diphenhydramin HCl dengan persyaratan 98.0% - 102%. Kata Kunci : Pengembangan metoda, UPLC, HPLC, Obat batuk cair. PENDAHULUAN Zaman telah menuntut kita untuk semakin cepat dalam segala hal, tidak terkecuali dalam hal kecepatan analisis. Seiring berjalannya waktu setiap orang, perusahaan, atau badan penelitian selalu mencari metode yang lebih cepat, tepat, dan efisien untuk suatu pemeriksaan. Sejalan dengan perkembangan ilmu sains dan teknologi, metode analisis dari zaman ke zaman juga mengalami perubahan. Perubahan metoda tersebut disesuaikan dengan peruntukannya, dapat karena kondisi yang berubah, 1

2 ataupun karena tututan kecepatan analisis. Metode yang umumnya saat ini sering digunakan oleh Industri Farmasi, salah satunya adalah HPLC terutama untuk industri yang menjadikan United State Pharmacopeae (USP) sebagai standar. Dengan diperkenalkannya UPLC ke dunia industri maka banyak dari industri farmasi yang beralih dari HPLC ke UPLC untuk pemeriksaan kadar zat aktifnya. Pemeriksaan yang saat ini dilakukan sebelumnya yang menggunakan HPLC merupakan analisis yang bisa dikategorikan cepat, tetapi di industri mereka membutuhkan analisis yang lebih cepat dari ini. Hal ini dikarenakan tuntutan untuk merilis produk dengan waktu yang cepat, dan ditambah dengan jumlah lot produk yang banyak. Metode yang saat ini berlaku untuk analisis Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramin HCl dalam seddiaan obat batuk cair di tempat penelitian adalah menggunakan High Performance Liquid Chromatograph (HPLC) dengan run time (waktu Injeksi) menit untuk satu injeksi, dan penulis akan mencoba menggunakan instrumen yang dapat memisahkan komponen lebih cepat dari HPLC. Pada penelitian sebelumnya untuk penetapan vitamin B1, B2, dan B6 pada suatu minuman suplemen multivitamin menggunakan HPLC pada tekanan < 4000 psi membutuhkan waktu 15 menit dengan metoda fase gerak gradien, dan hanya membutuhkan waktu 3 menit jika menggunakan UPLC pada tekanan 4000 Psi Psi. Sehingga diharapkan dengan pengembangan metoda ini ke UPLC akan didapatkan run time yang jauh lebih singkat. Penelitian yang dilakukan akan meliputi pengujian kesesuaian sistem menggunakan HPLC dengan parameter resolusi (daya pisah), simpangan baku relatif (RSD), dan tailing factor (faktor pengekoran), lalu pencarian laju alir yang optimum pada Ultra Performance Liquid Chromatograph (UPLC) dengan cara membandingkan hasil parameter uji kesesuaian sistem UPLC dengan parameter resolusi (daya pisah), simpangan baku relatif (RSD), dan tailing factor (faktor pengekoran) pada laju alir 0.2, 0.3, dan 0.4 ml/menit. Jika telah didapatkan laju alir yang optimum maka dilakukan verifikasi metode dengan laju alir optimum yang didapatkan terhadap parameter verifikasi yang meliputi selektifitas (resolusi), presisi (RSD area), dan akurasi. Pengujian kesesuaian sistem dilakukan untuk mengetahui apakah alat, metode dan sistem kromatografi cair kinerja tinggi yang digunakan dapat memberikan hasil yang baik dalam proses analisis. Verifikasi merupakan proses pembuktian bahwa laboratorium uji mampu mendemonstrasikan bahwa metode analisis yang digunakan memiliki kelayakan kinerja untuk melakukan sebuah penetapan rutin sesuai dengan karakteristik kinerja metode. Hal ini mensyaratkan dilakukannya pengujian terhadap parameter kinerja metode pada penelitianini meliputi selektifitas, presisi, dan akurasi. Selektifitas adalah kemampuan metode analisis untuk membedakan analat yang akan ditetapkan terhadap senyawaan lain yang terdapat dalam sampel. Selektifitas atau spesifitas suatu metode menyatakan kemampuan penetapan secara akurat dan khusus dari komponen lain yang dicurigai dapat mengganggu kondisi pengujian. 2

3 Pengujian selektifitas pada KCKT mengacu pada nilai resolusi yang dihasilkan dari kromatogram. Presisi didefinikan sebagai nilai kedekatan dari hasil analisis yang dapat diterima, dengan tujuan mengetahui kesalahan akibat operator. Presisi diterapkan pada pengukuran berulang (Repeatability) yang menunjukkan hasil pengukuran individual didistribusikan di sekitar nilai rata-rata dengan mengabaikan letak nilai rata-rata terhadap nilai yang sebenarnya. Akurasi menyatakan seberapa dekat nilai hasil pengukuran dengan nilai sebenarnya (true value) atau nilai yang dianggap benar (accepted value). Nilai akurasi dapat ditunjukkan oleh nilai keperolehan kembali (% recovery). Pengulangan verifikasi perlu dilakukan jika dalam tahapan analisis terindikasi perlunya dilakukan modifikasi metode. Verifikasi juga harus dilakukan jika: Terjadi pergantian instrumen analisis Terjadi pergantian pereaksi yang spesifik Terjadi perubahan pada pengaturan laboratorium yang dapat mempengaruhi hasil analisis Metode digunakan pertama kali oleh staf baru Metode telah digunakan dalam waktu yang cukup lama (Wood et al., 2004). Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan metode yang lebih cepat dan lebih efisien untuk metode analisis Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramin HCl dengan pemanfaatan UPLC. Dugaan sementara penelitian ini metode analisis Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramin HCl pada sediaan obat batuk cair menggunakan UPLC lebih cepat dan efisien dibandingkan dengan HPLC. METODE PENELITIAN Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah working standar Diphenhydramin HCl dan Dextromethorphan HBr, acetonitrile HPLC grade, Asetonitril untuk, asam trifloroasetat (TFA), dan aquabidest. Alat yang digunakan adalah HPLC Waters 2487, UPLC Waters, vial Waters, syring 10 ml, penyaring 0.45 nm, penyaring 0.2 nm, labu ukur 50 ml, labu ukur 20 ml, pipet ukur 2.0 ml, pipet serologi 10 ml, ultrasonic, vortex, sentrifuse, botol eluen, dan neraca analitik Metler Toledo. Metode Kerja Sistem Kromatografi HPLC Sistem kromatografi HPLC yang digunakan mempunyai perbandingan fasa gerak asetonitril dengan trifluoro acetic acid (TFA) 0.1% sebanyak 38:62, volume Injeksi 20 µl, Jenis kolom Waters Atlantis dc 18 4,6 x 150 mm dengan ukuran partikel 5µm, detektor UV dengan panjang gelombang 220 nm, laju alir 1,0 ml/menit, dan dengan suhu ruangan (tanpa oven). Sistem Kromatografi UPLC Sistem kromatografi UPLC yang akan digunakan mempunyai perbandingan fasa gerak asetonitril dengan trifluoro acetic acid (TFA) 0.1% sebanyak 38:62, volume Injeksi 1.4 µl, Jenis kolom Acquity UPLC HSS T3 2,1 mm x 50 mm dengan ukuran partikel 1.8 µm, detektor UV dengan panjang gelombang 220 nm, laju alir 0.20 ml/menit, 0.30 ml/menit, dan 0.4 ml/menit dengan suhu ruangan (tanpa oven). 3

4 Untuk penyiapan larutan standar untuk uji kesesuaian sistem ditimbang 62.5 mg working standar Diphenhydramin HCl dan 37.5 mg working standar Dextromethorphan HBr. Dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml dilarutkan, dihimpitkan dengan aquabidest, dan dipipet sebanyak 2.0 ml kedalam labu ukur 20 ml. Larutan ditambahkan dengan methanol hingga tanda tera kemudian dihomogenkan (Larutan Standar-> 125 µg/ml Diphenhydramin HCl, dan 75 µg/ml Dextromethorphan HBr) Uji kesesuaian sistem Diphenhydramin HCl dan Dextromethorphan HBr menggunakan HPLC Dilakukan dengan cara disaring larutan standar menggunakan filter 0.45 µm. Diinjeksikan larutan standar dan sampel pada laju alir 1.0 ml/menit. Dihitung nilai parameter kesesuaian sistemnya yang meliputi resolusi (daya pisah), presisi, dan faktor asimetri puncak. Uji kesesuaian sistem Diphenhydramin HCl dan Dextromethorphan HBr menggunakan UPLC Dilakukan dengan cara disaring larutan standar menggunakan filter 0.20 µm, diinjeksikan larutan standar pada laju alir 0.20 ml/menit, 0.30 ml/menit, dan 0.40 ml/menit sebanyak 5 kali, dibandingkan nilai parameter uji kesesuaian sistemnya pada masing masing laju alir yang meliputi resolusi, simpangan baku relatif area puncak, dan faktor asimetri puncak. Dalam kromatografi gas (GC) dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT/HPLC), resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak yang saling berdekatan (Δt R = t R2 -t R1 ) dibagi dengan rata-rata lebar puncak (W 1 + W 2 )/2 Uji simpangan baku relatif kesesuaian sistem dilakukan dengan perhitungan menggunakan data kromatogram dari hasil lima kali pengulangan injeksi standar dengan konsentrasi yang sama ke dalam alat KCKT. Batas simpangan baku relatif uji kesesuaian sistem adalah 2,0% (Ditjen POM, 1995) Rumus untuk perhitungan simpangan baku relatif adalah : SB i n i 1 Xi - X n 1 SB RSD 100% X Keterangan : SD = Standar deviasi/ simpangan baku (SB) Xi X = Simpangan dan observasi terhadap rata-rata sampel N = Banyaknya data RSD = Relatif standar deviasi/ simpangan baku relatif X = Rata-rata kadar Puncak asimetri muncul karena berbagai faktor. Peningkatan puncak yang asimetri akan menyebabkan penurunan resolusi, batas deteksi, dan standar deviasi. Gambar 1. Contoh perhitungan faktor asimetri 2 4

5 Keterangan : a = ½ Puncak awal b = ½ Puncak ekor h = Tinggi puncak Syarat kesesuaian sistem yang digunakan di internal Quality Control (QC) PT. Kalbe Farma adalah : Tabel 1. Syarat kesesuaian sistem PT. Kalbe Farma Tbk Parameter Nilai Faktor Asimetri < 2,0 Simpangan Baku Relatif < 2,0 % Resolusi > 1.5 Setelah di dapatkan laju alir yang mempunyai nilai resolusi, simpangan baku relatif area puncak, dan faktor asimetri puncak paling baik, dilakukan verifikasi terhadap laju alir yang memiliki nilai kesesuaian sistem paling baik yang meliputi selektifitas, presisi, dan akurasi. Uji verifikasi dengan parameter selektifitas Larutan standar disaring menggunakan filter 0.20µm, diinjeksikan ke dalan sistem UPLC sebanyak 5 kali dengan laju alir yang memiliki nilai parameter kesesuaian sistem paling baik. Dihitung nilai resolusi dari puncak kromatogram Diphenhydramin HCl dan Dextromethorphan HBr yang dihasilkan. Perhitungan dan data untuk uji selektifitas sama dengan uji resolusi kesesuaian sistem. Syarat penerimaan uji verifikasi dengan parameter selektifitas adalah > 1.5. Uji verifikasi dengan parameter presisi. Standar disaring menggunakan filter 0.20µm, diinjeksikan ke dalan sistem UPLC sebanyak 10 kali dengan laju alir yang memiliki nilai parameter kesesuaian sistem paling baik. Dihitung nilai simpangan baku relatif area dari kromatogram Diphenhydramin HCl dan Dextromethorphan HBr yang dihasilkan. Syarat penerimaan uji verifikasi dengan parameter presisi adalah simpangan baku relatif area puncak dari 10 injeksi > 1.5%. Uji verifikasi dengan parameter akurasi. Sejumlah zat aktif yang telah ditimbang dicampurkan dengan plasebo sehingga menghasilkan campuran dengan kadar 80%, 100% dan 120%, masing-masing diuji triplo. Disiapkan masing-masing konsentrasi sebanyak 3 replikasi (BPOM, 2006). Diinjeksikan masing-masing dari larutan sampel tersebut dan juga larutan standar ke dalam sistem UPLC. Dihitung kadar, % recovery, dan simpangan baku relative % recovery dari Diphenhydramin HCl dan Dextromethorphan HBr. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Analisis kesesuaian sistem Diphenhydramin HCl dan HPLC Pada Uji kesesuaian sistem Diphenhydramin HCl dan HPLC pada laju alir 1.0 ml/menit menghasilkan kromatogram seperti ditunjukkan gambar 1 berikut : 5

6 Diphenhydramin HCl Dextromethophan HBr Gambar 2. Kromatogram pemeriksaan kadar Diphenhydramin HCl dan HPLC. Pada gambar 1 diatas menunjukkan hasil kromatogram Diphenhydramin HCl dan HPLC dengan metoda yang telah tervalidasi sebelumnya dan menjadi metoda pemeriksaan rutin. Dari data 5 kali replikasi injeksi menunjukkan hasil memenuhi syarat yang dapat dilihat pada tabel dibawah ini : Tabel 2. Hasil uji kesesuaian sistem Dextromethorpan HBr dan Diphenhydramin HCl dengan HPLC Zat Aktif Parameter Hasil Persyaratan Waktu Retensi Simpangan Baku Relatif Faktor Asimetri % < 2.0% < 2.0% Resolusi - > 1.5 Waktu Retensi Simpangan Baku Relatif Faktor Asimetri % < 2.0% < 2.0% Resolusi > 1.5 Tabel 2 diatas menunjukkan Dextromethorphan HBr mempunyai waktu retensi menit, faktor asimetri puncak persyaratan < 2, simpangan baku relatif luas area puncak 0.62% dengan persyaratan < 2%. Diphenhydramin HCl mempunyai waktu retensi menit, faktor asimetri puncak dengan persyaratan < 2, dan simpangan baku relatif luas area puncak 0.70% dengan persyaratan < 2%. dan resolusi dengan persyaratan > 1.5. Dextromethorphan HBr mempunyai waktu retensi yang lebih cepat dikarenakan sifatnya yang lebih mudah larut dalam fasa gerak dengan komposisi asetonitril : TFA 0.1% (dalam air) dengan perbandingan 38 : 62, jika dibandingkan dengan Diphenhydramine HCl. Uji kesesuaian sistem Diphenhydramin HCl dan Dextromethorphan HBr menggunakan UPLC dengan 3 laju alir. Pada Uji kesesuaian sistem Diphenhydramin HCl dan UPLC dengan laju alir 0.2 ml/menit, 0.3 ml/menit, dan 0.4 ml/menit menghasilkan kromatogram seperti ditunjukkan gambar berikut : Gambar 3. Kromatogram pemeriksaan kadar Diphenhydramin HCl dan UPLC dengan laju alir 0.2 ml/menit. 6

7 Dextromethophan HBr Diphenhydramin HCl Gambar 4. Kromatogram pemeriksaan kadar Diphenhydramin HCl dan UPLC dengan laju alir 0.3 ml/menit. Gambar 5. Kromatogram pemeriksaan kadar Diphenhydramin HCl dan UPLC dengan laju alir 0.4 ml/menit. Dari ketiga kromatogram di atas didapatkan hasil yang ditunjukkan pada tabel di bawah ini : Tabel 3. Hasil uji kesesuaian sistem Dextromethorpan HBr dan Diphenhydramin HCl dengan UPLC Zat Aktif Parameter Waktu Retensi Simpangan Baku Relatif Faktor Asimetri Resolusi Laju Alir (ml/ menit) Hasil Syarat - < 2.0% < 2.0 > 1.5 Waktu Retensi Simpangan Baku Relatif Faktor Asimetri Resolusi < 2.0% < 2.0 > 1.5 Dari hasil pengujian kesesuaian sistem yang ditampilkan pada tabel 3 diatas didapatkan hasil bahwa semua parameter kesesuaian sistem yang meliputi simpangan baku relatif, faktor asimetri, dan resolusi pada laju alir 0.2 ml/menit, 0.3 ml/menit, dan 0.4ml/menit memenuhi standar dengan persyaratan simpangan baku relatif tidak lebih dari 2.0%, faktor asimetri tidak lebih dari 2.0, dan resolusi tidak kurang dari 1.5. verifikasi dilakukan terhadap metoda yang memiliki laju alir 0.3 ml/menit dikarenakan pengujian pada laju alir ini memiliki waktu retensi lebih cepat dari laju alir 0.2 ml/menit dan memiliki nilai resolusi, faktor asimetris, dan simpangan baku relatif yang masih dapat diterima jika merujuk ke persyaratan tempat dilakukannya penelitian, yang dapat dilihat pada tabel 1. Sedangkan untuk hasil uji kesesuaian sistem pada laju alir 0,4 ml/menit walaupun mempunyai waktu retensi lebih cepat mempunyai simpangan baku relatif yang jauh lebih besar jika dibandingkan dengan laju alir 0.2 ml/menit dan 0.3 ml/menit. 7

8 Verifikasi metoda dengan laju alir 0.3 ml/menit Verifikasi yang dilakukan meliputi parameter selektifitas, presisi, dan akurasi Selektifitas Hasil yang didapatkan dari uji selektifitas, ditunjukan oleh nilai resolusi ditunjukkan pada tabel di bawah ini: Tabel 4. Hasil Uji selektifitas pada laju alir 0.3 ml/menit dengan UPLC Pengulangan Resolusi Syarat Rata rata > 1.5 Hasil uji selektifitas yang ditunjukkan pada tabel diatas, menunjukkan nilai yang memenuhi syarat resolusi > 1.5 pada setiap pengulangan Presisi Hasil yang didapatkan dari uji presisi, untuk Dextromethorphan HBr ditunjukan oleh nilai simpangan baku relatif ditunjukkan pada tabel di bawah ini: Tabel 5. Data hasil uji presisi Dextromethorphan HBr Pengulangan Area Rata- rata Std % RSD 0.50% Tabel diatas menunjukkan hasil simpangan baku relatif puncak Dextromethorphan HBr memenuhi persyaratan < 2.0% dengan nilai 0.50%. Hasil uji presisi untuk Diphenhydramine HCl ditunjukkan oleh tabel dibawah ini : Tabel 6. Data hasil uji presisi Diphenhydramine HCl Pengulangan Area Rata- rata Std % RSD 0.55% Tabel diatas menunjukkan hasil simpangan baku relatif puncak Dextromethorphan HBr memenuhi persyaratan < 2.0% dengan nilai 0.50%. 8

9 Akurasi Hasil yang didapatkan dari uji akurasi, untuk Dextromethorphan HBr ditunjukan oleh nilai %Recovery (nilai perolehan kembali) pada tabel di bawah ini: Tabel 7. Data hasil uji akurasi Dextromethorphan HBr No Kadar Kadar % Terhitung Teoritis Recovery 1 79, , , , , , , , , , , , , , , , , ,94 Rata-rata 99,97 Tabel diatas menunjukkan hasil %Recovery Dextromethorphan HBr memenuhi persyaratan 98.0% % dengan nilai 99.97%%. Hasil uji akurasi untuk Diphenhydramine HCl ditunjukkan oleh tabel dibawah ini : Tabel 8. Data hasil uji akurasi Diphenhydramine HCl No Kadar Kadar % Terhitung Teoritis Recovery 1 80, , , , , , , , , , , , , , , , , ,46 Rata-rata Tabel diatas menunjukkan hasil %Recovery Diphenhydramine HCl memenuhi persyaratan 98.0% % dengan nilai 0.50%. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian pengembangan metode analisis dextromethorphan Hbr dan diphenhydramin HCl dalam sediaan obat batuk cair menggunakan UPLC, dapat disimpulkan bahwa : 1. Laju alir yang optimal pada metode analisis Dextromethorphan Hbr dan Diphenhydramin HCl dalam sediaan obat batuk cair menggunakan UPLC adalah 0.30 ml/menit dengan waktu retensi Dextromethorphan HBr menit dan untuk Diphenhydramine HCl menit yang sebelumnya pada HPLC Dextromethorphan HBr menit dan Diphenhydramine HCl menit. 2. Setelah diverifikasi didapat hasil yang memenuhi persyaratan uji verifikasi yaitu dengan resolusi dengan persyaratan > 1.5, simpangan baku relatif (RSD) 0.50% untuk Dextromethorphan HBr, 0.55% untuk Diphenhydramin HCl dengan persyaratan < 2.0%, dan recovery 99,97% untuk Dextromethorphan HBr, % untuk Diphenhydramin HCl dengan persyaratan 98.0% - 102%. Saran Metode ini disarankan untuk validasi lengkap agar dapat digunakan sebagai metode untuk pemeriksaan rutin dan dilakukan penelitian lebih lanjut untuk pemeriksaan Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramine HCl dalam sediaan selain cairan ataupun sediaan cairan dengan plasebo yang berbeda. 9

10 DAFTAR PUSTAKA Ahuja S, and Rasmussen H HPLC Method Development for Pharmaceuticals. 1st ed. USA : Elsevier Academic Press. Asmoro W Ketrampilan Dasar Anastesiologi I Farmakologi Terapan. Modul 1-E. Solo: Bagian Anastesiologi Dan Reaminasi RSUD Dr.Moewardi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakrta. pp Azhar Penerapan Metoda Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Pada Penetapan Kadar Kloramfenikol dalam Sediaan Kapsul. Medan: Universitas Sumatera Utara. Danusantoso,H Batuk. Penerbit Universitas Trisakti. Jakarta Ditjen POM. (1995). Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Hal Douglas Skoog, F. James Holler, Timothy Nieman Principles of Instrumental Analysis, 5 th Edition. Philadelphia : Saunders College Publishing Halim, D. (1996). Batuk. Jakarta: Universitas Trisakti. Hal masiobat. Diakses tanggal 11 mei 2011 Johnson,E.L Dasar Kromatografi Cair. Penerbit ITB. Bandung Swartz, Michael HPLC to UPLC Method Migration. Waters Tan, H. T., dan Kirana, R. (1978). Obatobat penting. Jakarta: Elex Media Komputindo Kelompok Gramedia. Hal Tisnadjaja, Djadjat, Dkk Pengkajian Kandungan Fitosterol pada Tanaman Kedawung (Parkia roxburgii G. Don.).Bogor : Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Tjay,T.H dan Kirana Rahardja Obat-Obat Penting. Edisi Ketujuh. Cetakan Pertama. PT. Elex Media Komputindo. Jakarta. Underwood,A.L Analisa Kimia Kuantitatif.Edisi keempat. Jakarta: Erlangga Wood, R., L. Foster, A. Damant dan P. Key Analytical Methods for Food Additives. Woodhead Publishing Ltd., England. Yahya,M dan Rizali.H.Nasution Pengantar Farmakologi. Cetakan Kedua. Pustaka Widyasarana. Medan. 10