BAB 3 BAHAN DAN METODA

Transkripsi

1 BAB 3 BAHAN DAN METODA 3.1. Rancangan Penelitian Rancangan penelitian berupa penelitian deskriptif analitik dengan pendekatan secara cross sectional Tempat dan Waktu Penelitian Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di Sentra Diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran, Instalasi Patologi Anatomi RS. H. Adam Malik Medan dan Laboratorium Patologi Anatomi swasta dan pribadi di Medan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan mulai mulai bulan Juli 2010 sampai April 2011 yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, pengumpulan sampel, penelitian dan hasil penelitian.

2 3.3. Subjek Penelitian Populasi Populasi dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin yang berasal dari jaringan nasofaring yang didiagnosa sebagai karsinoma nasofaring pada sentra diagnosis Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU, Instalasi Patologi Anatomi RS. H. Adam Malik Medan dan Laboratorium Patologi Anatomi Swasta dan Pribadi kota Medan Sampel Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari jaringan nasofaring yang sesuai dengan kriteria inklusi dan sesuai dengan besar sampel penelitian Jumlah Sampel Jumlah sampel yang diperlukan adalah berdasarkan hasil perhitungan dengan melihat proporsi yang digunakan pada kasus ini sebesar 50% karena belum ada penelitian mengenai tampilan matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schimncke. Dengan tingkat

3 kemaknaan yang dipergunakan pada penelitian ini adalah 0,05 dengan interval kepercayaan 95%. Dari tabel didapat Z α = 1,96 Jumlah sampel dihitung dengan rumus : n = z α 2 PQ d 2 n = besar sampel p = proporsi penelitian q = 100% - p α = tingkat kemaknaan Tingkat kemaknaan yang dipergunakan pada penelitian ini adalah 0,05 dengan interval kepercayaan 95%. Dari tabel didapat Z α = 1,96 d = tingkat kesalahan (15%) Sehingga : n = (1,96) 2 (0,5) (0,5) (0,15) 2 = 42,68 43 Jumlah sampel minimal 43 sampel 53 sampel.

4 3.5. Kriteria Penelitian Kriteria Inklusi: Yang termasuk kriteria inklusi adalah sediaan blok parafin jaringan nasofaring dengan slide pulasan Hematoksilin Eosin yang didiagnosa dengan undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke Kriteria Eksklusi: 1.Sediaan blok parafin yang didiagnosa dengan keratinizing squamous cell carcinoma, differentiated type nonkeratinizing squamous cell carcinoma dan basaloid squamous cell carcinoma. 2. Sediaan blok paraffin dari undifferentiated carcinoma yang tidak bisa dibedakan tipenya. 3..Sediaan blok parafin yang rusak dan tidak dapat diproses lebih lanjut dengan pulasan Matrix metalloproteinase Cara Kerja 1. Semua slide yang berasal dari nasofaring yang telah didiagnosa sebagai carcinoma. 2. Dilakukan pembacaan ulang oleh dua orang pathologist bersamaan dengam peneliti untuk memisahkan antara keratinizing squamous cell

5 carcinoma, differentiated type non keratinizing squamous cell carcinoma, undifferentiated type non keratinizing squamous cell carcinoma (undifferentiated carcinoma) dan basaloid squamous cell carcinoma (Diagnosa berdasarkan pada klasifikasi WHO tahun 2005). 3. Kemudian undifferentiated carcinoma nasofaring dipisahkan kembali menjadi tipe Regaud dan tipe Schmincke (pembagian Ackerman) 4. Dilakukan pemotongan ulang blok paraffin. 5. Pewarnaan dengan imunohistokimia Matrix Metalloproteinase Tampilan dari Matrix Metalloproteinase Pembuatan Sediaan Mikroskopis Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut : 1.Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer sampai cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 4 µm. Setiap blok parafin, dipotong ulang 1 kali untuk pulasan imunohistokimia matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). 2.Sampel blok parafin yang sudah dipotong tipis (4 µm) ditempelkan pada kaca objek.

6 Pada pulasan imunohistokimia MMP-9 digunakan kaca objek yang telah dicoating dengan poly-l-lysine atau Silanized slide agar jaringan dapat menempel pada kaca objek selama proses pulasan imunohistokimia. Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek coated adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing. Potongan tipis dipisahkan dan diratakan dengan memasukkannya ke dalam air hangat. Setelah mengembang, pindahkan ke atas kaca objek. Selanjutnya, kaca objek diletakkan di atas alat pemanas (hot plate) 50-60⁰C. Setelah parafin melunak, kaca objek dikeringkan dan potongan jaringan siap untuk dipulas Prosedur sebelum pulasan antibodi primer. 1.Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4 µm yang sudah ditempelkan pada kaca objek silanized. 2.Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam cairan xylol sebanyak 3 kali, masing-masing 5 menit. 3.Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam etanol 98% sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit, kemudian alkohol 90%, 80% dan 70% masing-masing selama 5 menit. 4.Bilas dengan air mengalir selama 5 menit. 5. Blocking preparat dengan mencelupkannya kedalam Endogen Peroksidase 0,5% (Methanol + H2O2) selama 30 menit. 6. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit.

7 7. Masukkan preparat ke dalam buffer sitrat dan dipanaskan kedalam microwave: Cook I, power level 8 selama 5 menit. Cook II, power level 1 selama 5 menit. 8. Dinginkan ± 30 menit dalam suhu ruangan. 9. Bilas dalam PBS ph 7,4 selama 3 menit dan keringkan air disekitar potongan jaringan. 10. Tandai di sekeliling jaringan yang ingin dipulas dengan Pap Pen. 11. Blocking preparat dengan meneteskan Normal Horse Serum 5% dan dibiarkan selama 15 menit didalam bak inkubasi Protokol Pemulasan Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) dengan menggunakan The Envision+ Dual Link System dari Dako Bersihkan preparat dari Normal Horse Serum. Teteskan preparat dengan antibodi primer matrix metalloproteinase-9 dan biarkan selama 60 menit dalam rak inkubasi. Cuci dengan PBS ph 7,4 selama 3 menit. Teteskan preparat dengan Dako REAL En Visison secukupnya dan dibiarkan selama 30 menit dalam rak inkubasi. Cuci dalam PBS ph 7,4 + Tween 20.

8 Teteskan preparat dengan DAB + substrat buffer (Dako) dan biarkan selama 2-5 menit. Bilas dengan air mengalir selama 10 menit. Countrstain preparat dengan pewarnaan Hematoxillin selama 1-2 menit. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit. Masukkan preparat kedalam larutan lithium carbonat jenuh ( 5% dalam aquadest) selama 2 menit. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit. Dehidrasi dengan cara mencelupkan preparat secara berurutan dalam etanol 70%,80%,96% dan etanol absolut, masing-masing selama 5 menit. Clearing dengan cara mencelupkan preparat ke dalam larutan xylol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit. Lakukan mounting dan tutp dengan kaca penutup. 3.7.Alat dan Bahan Penelitian Alat-Alat Penelitian Alat-alat yang diperlukan dalam penelitian ini adalah : mikrotom, waterbath, hot plate, freezer, inkkubator, staining jar, rak kaca objek, kaca objek, rak inkubasi, Pap Pen, pipet miro, timbangan bahan kimia, kertas

9 saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker, tabung sentrifuge, microwave, thermolyte stirrer, entelan dan mikroskop cahaya Bahan Penelitian Blok parafin yang telah didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin Eosin sebagai undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke Pulasan imunohistokimia menggunakan metode The EnVision+ Dual Link System kit, teknik pulasan imunohistokimia 2 langkah. Antibodi primer yang digunakan adalah Rabbit Polyclonal Hu-antibody MMP-9 dengan pengenceran 1 : 100. Detection kit terdiri dari : 1 botol endogenous enzyme block 1 botol Normal Horse Serum 5% 1 botol Dako REAL En VISION 1 botol DAB+ substrat chromogen Larutan Buffer sitrat Larutan PBS ph7,4 : Natrium Chloride Kalium chloride Na2HPO4 : 80 gram : 2 gram : 11gram

10 KH2PO4 : 2 gram Tambahkan aquadest : 1000 ml Larutan Tweet 20 Larutan DAB + substrat buffer (1 ml larutan cukup untuk 10 jaringan) Langakah 1: masukkan 1 ml aliquot substrat buffer secukupnya kedalam countainer ( tergantung dari jumlah spesimen yang akan dikerjakan) Langkah 2 : untuk setiap 1 ml buffer, tambahkan satu tetes (20 mikroliter )cairan DAB + substrat chromogen dan campurkan segera. Larutan couterstain Mayers Haematoxillin Larutan lithium karbonas 50 gram lithium karbonas ditambah dengan aquadest 1000 ml Etanol absolute 96%,80%,70% Larutan xylol.

11 3.8.Instrumen Penelitian Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pulasan imunohistokimia MMP-9 terhadap sampel sediaan jaringan nasofaring. Untuk penilaian terhadap pulasan imunohistokimia MMP-9 adalah sebagai berikut : Kontrol positif : jaringan yang telah diketahui positif terhadap MMP- 9 pada penelitian terdahulu (dalam hal ini limfoma) Kontrol negatif : omit primary antibody Positif : warna coklat yang tertampil pada sitoplasma sel epitel maupun stroma.

12 3.9. Kerangka Operasional Slide dari nasofaring yang didiagnosa dengan carcinoma Pembacaan ulang Keratinizing squamous cell carcinoma Differentiated type Non Keratinizing Squamous Cell Carcinoma Undifferentiated type Basaloid squamous cell carcinoma Tipe Regaud Tipe Schmincke Potong ulang blok parafin Potong ulang blok parafin Keterangan : Kriteria ekslusi Pewarnaan Imunohistokimia MMP 9 Distribusi Ekspresi MMP-9

13 3.10. Variabel Penelitian Variabel yang diteliti adalah : a. Variabel bebas adalah undifferentiated carcinoma nasofaring : tipe Regaud dan tipe Schmincke. b.variabel terikat adalah tampilan imunohistokimia matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipeschmincke Definisi Operasional 1.Karsinoma nasofaring adalah tumor yang berasal dari sel-sel epitelial yang menutupi permukaan nasofaring. 3. Undifferentiated carcinoma nasofaring terdiri dari sel-sel yang uniform dengan inti vesikuler, inti yang menonjol dan batas sel yang tidak jelas sehingga membentuk pola pertumbuhan syncitial dengan stroma yang diinfiltrasi oleh sel-sel radang. 4. Tipe Regaud yaitu tipe dari undifferentiated carcinoma yang terdiri dari kelompokan sel-sel epithelial neoplastik dengan batas yang jelas yang dikelilingi oleh jaringan ikat fibrous dan sel-sel radang. 5. Tipe Schmincke adalah tipe dari undifferentiated carcinoma yang terdiri dari sel-sel epitelial neoplastik yang tumbuh difus dan bercampur dengan sel-sel radang.

14 6.Imunohistokimia adalah metoda pewarnaan dengan perpaduan antara reaksi imunologi dan kimiawi, dimana reaksi imunologi ditandai adanya reaksi antara antigen dengan antibodi, dan reaksi kimiawi ditandai dengan adanya reaksi antara enzim dengan substrat. 7.Matrix metalloproteinase-9 adalah ZN 2+ dependent endopeptidase yang memediasi degradasi dari protein matrix extracellular dan berhubungan dengan invasi tumor dan metastase. 8.Hasil pulasan immunohistokimia MMP-9 adalah tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel epitel dan stroma yang dinyatakan dengan : Negatif, bila tidak berhasil menampilkan warna coklat, dimana pada saat proses yang sama kontrol (+) menampilkan warna coklat dengan pewarnaan kromogen DAB. Positif, bila terlihat tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel epitel ataupun stroma dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400X pada 5 lokasi lapangan pandang dan pada saat yang sama kontrol (+) juga menampilkan warna yang sama. Yang dinilai pada jaringan yaitu : o Skor tampilan warna coklat : +1 = lemah +2 = sedang +3 = kuat

15 o Skor jumlah sel yang terwarnai 0 = Tidak ada sel yang terwarnai +1 = < 25% sel yang terwarnai +2 = 25%-75% sel yang terwarnai +3 = > 75% sel yang terwarnai o Skor intensitas warna = skor jumlah sel yang terwarnai x skor tampilan warna Interpretasi skor intensitas warna : Lemah : 1-3 Sedang : 4-6 Kuat : 7-9 Adapun cara menginterpretasikan tampilan imunohistokimia tersebut diatas adalah modifikasi dari Q score Analisis Data. 1. Untuk melihat gambaran karakteristik penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke disajikan dalam bentuk tabulasi dan dideskripsikan. 2. Untuk menganalisa perbedaan tampilan imunohistokimia matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) antara undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke peneliti menggunakan uji Chisquare.

16 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Penelitian Pemeriksaan imunohistokimia matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) dilakukan terhadap 53 sediaan blok parafin jaringan histopatologi dari biopsi nasofaring yang sebelumnya telah didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin & Eosin sebagai undifferentiated carcinoma nasofaring yang kemudian dikelompokkan menjadi tipe Regaud sebanyak 27 kasus (50,9%) dan tipe Schmincke sebanyak 26 kasus (49,1%). Karakteristik Penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke adalah sebagai berikut : Tabel 4.1. Distribusi Penderita Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Regaud Berdasarkan Jenis Kelamin Jenis Kelamin Jumlah (n) Presentase (%) Laki-Laki 21 77,78 Perempuan 6 22,22 Jumlah ,00 Tabel 4.1. Memperlihatkan bahwa berdasarkan jenis kelamin, penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud lebih banyak dijumpai pada lakilaki yaitu 21 kasus (77,78%).

17 Tabel 4.2. Distribusi Penderita Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Regaud Berdasarkan Umur Umur Jumlah (n) Persentase(%) < , , , , ,41 Jumlah Tabel 4.2. memperlihatkan bahwa berdasarkan umur, penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud paling banyak dijumpai pada kelompok umur tahun yaitu 11 kasus (40,74%). Tabel 4.3. Distribusi Penderita Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Schmincke Berdasarkan Jenis Kelamin Jenis Kelamin Jumlah (n) Presentase (%) Laki-Laki 17 65,38 Perempuan 9 34,62 Jumlah ,00 Tabel 4.3. Memperlihatkan bahwa berdasarkan jenis kelamin, penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke lebih banyak dijumpai pada laki-laki yaitu 17 kasus (65,38%).

18 Tabel 4.4. Distribusi Penderita Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Schmincke Berdasarkan Umur Umur Jumlah (n) Persentase(%) <30 2 7, , , , ,53 Jumlah Tabel 4.4. memperlihatkan bahwa berdasarkan umur, penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke paling banyak dijumpai pada kelompok umur tahun sebanyak 8 kasus (30,77% ) kemudian diikuti dengan kelompok umur tahun sebanyak 7 kasus (26,92%). Tabel 4.5. Proporsi Undifferentiated Carcinoma Nasofaring tipe Schmincke dan Regaud dan Skor Jumlah Sel yang Terwarnai Jumlah yang terwarnai sel Tipe Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Schmincke Regaud Total X 2 p value <25% 15 (57,7%) 14 (51,9%) 29 (54,7%) 25%-75% 3 (11,5%) 5 (18,5%) 8 (15,1%) 0,516 0,773 >75% 8 (30,8%) 8 (29,6%) 16 (30,2%) Total 26 (100,0%) 27 (100,0%) 53 (100,0%) Keterangan: X 2 = Chi Square

19 Pada tabel 4.5 didapatkan pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke jumlah sel yang terpulas paling banyak adalah < 25% sebanyak 15 kasus (57,7%) dan tipe Regaud sebanyak 14 kasus (51,9%). Jumlah sel yang terpulas 25%- 75% untuk undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke adalah sebanyak 3 kasus (11,5%) dan tipe Regaud sebanyak 5 kasus (18,5%). Sedangkan jumlah sel yang terpulas > 75% untuk undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke dan Regaud adalah sama yaitu masing-masing sebanyak 8 kasus (30,8% dan 29,6%). Setelah diuji dengan Chi Square, secara statistik tidak ada perbedaan proporsi jumlah sel yang terwarnai antara undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan Schmincke, dengan nilai p value > 0,05. Tabel 4.6. Proporsi Undifferentiated Carcinoma Nasofaring tipe Schmincke dan Regaud dengan Skor Tampilan Warna. Tampilan Warna Tipe Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Schmincke Regaud Total X 2 p value Lemah 15 (57,7%) 14 (51,9%) 29 (54,7%) Sedang 6 (23,1%) 7 (25,9%) 13 (24,5%) 0,184 0,912 Kuat 5 (19,2%) 6 (22,2%) 11 (20,8%) Total 26 (100,0%) 27 (100,0%) 53 (100,0%) Keterangan: X 2 = Chi Square

20 Tabel 4.6. memperlihatkan tampilan warna lemah dijumpai pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schimncke sebanyak 15 kasus (57,7%) dan tipe Regaud sebanyak 14 kasus (51,9%). Tampilan warna sedang pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke sebanyak 6 kasus (23,1%) dan tipe Regaud sebanyak 7 kasus (25,9%). Tampilan warna kuat dijumpai pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke sebanyak 5 kasus (19, 2%) dan tipe Regaud sebayak 6 kasus (22,2%). Setelah diuji dengan Chi Square, secara statistik tidak ada perbedaan proporsi tampilan warna antara undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan Schmincke, dengan nilai p value > 0,05 Tabel 4.7 Proporsi Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Schmincke dan Tipe Regaud dengan Interpretasi Intensitas Warna Intensitas Warna Tipe Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Schmincke Regaud Total X 2 p value Lemah 24 (92,4%) 22 (81,5%) 46 (86,8 %) Sedang 1 (3,8%) 4 (14,8%) 5 (9,4%) 1,869 0,393 Kuat 1 (3,8%) 1 (3,7%) 2 (3,8%) Total 26 (100,0%) 27 (100,0%) 53 (100,0%) Keterangan : X 2 = Chi Square

21 Dari tabel diatas, berdasarkan interpretasi intensitas warna, didapatkan pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan Schmincke interpretasi yang paling banyak adalah interpretasi lemah yaitu masing-masing 22 kasus (81,5%) dan 24 kasus (92,4%), sedangkan untuk interpretasi kuat masing-masing hanya sebanyak 1 kasus (3,8% dan 3,7%). Setelah diuji dengan Chi Square, secara statistik tidak ada perbedaan interpretasi intensitas warna antara undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan Schmincke, dengan nilai p value > 0, Pembahasan Dari penelitian ini didapatkan, berdasarkan jenis kelamin baik pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke lebih banyak dijumpai pada laki-laki dibandingkan pada perempuan ( tabel 4.1 dan tabel 4.3). Menurut Susworo R. karsinoma nasofaring lebih banyak dijumpai pada laki-laki dibandingkan perempuan dengan perbandingan 2-3 orang pria dibandingkan 1 wanita. Demikian juga dengan umur yang hampir memiliki distribusi yang sama, pada penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud paling banyak dijumpai pada kelompok umur tahun (tabel 4.2) dan pada tipe Schmincke paling banyak dijumpai pada kelompok umur tahun dan tahun (tabel 4.4). Hasil ini sesuai dengan Mills SE, bahwa karsinoma nasofaring memiliki

22 insidensi yang meningkat setelah usia 30 tahun dan insiden puncak pada usia tahun. Hasil pewarnaan dengan matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) tidak dijumpai perbedaan bermakna baik pada jumlah sel yang terwarnai, tampilan warna dan interpretasi intensitas warna terhadap undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke p> 0,05 (tabel 4.5, tabel 4.6 dan tabel 4.7). Menurut penelitian Zhen Liu dkk pasien dengan ekspresi matrix metalloproteinase yang tinggi memiliki angka ketahanan hidup yang lebih rendah. Sehingga dari hasil penelitian ini, untuk kemampuan melakukan invasi, tidak dijumpai perbedaan diantara kedua tipe undifferentiated carcinoma nasofaring ini namun hal ini belum dapat dijadikan dasar bahwa tidak dijumpai perbedaan prognosis dari kedua tipe ini karena masih ada faktor-faktor lain yang mempengaruhi prognosis seperti proliferasi pembuluh darah dan jumlah mitosis. Untuk kepentingan diagnosis, pencantuman tipe Regaud dan Schmincke pada undifferentiated carcinoma nasofaring dapat dilakukan karena memang terdapat perbedaan dalam morfologinya.

23 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan 1. Penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan Schmincke lebih banyak dijumpai pada laki-laki dibandingkan pada wanita. 2. Baik penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke memiliki distribusi kelompok umur yang hampir sama. 3. Tidak ada perbedaan proporsi baik pada jumlah sel yang terwarnai, tampilan warna dan interpretasi intensitas warna pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan Schmincke Saran Diperlukan penelitian lanjutan seperti melihat proliferasi pembuluh darah, jumlah mitosis atau dengan menggunakan pewarnaan imunohistokimia yang bekerja mendegradasi membran basal lainnya (seperti cathepsin L) untuk membuktikan bahwa memang benar-benar tidak dijumpai perbedaan agresifitas tumor pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke.