HPLC II. Indah Solihah

Transkripsi

1 HPLC II Indah Solihah

2 Teknik Elusi Isokratik: - teknik elusi menggunakan komposisi fase gerak tetap (polaritas tetap) selama proses kromatografi berlangsung Gradien: - teknik elusi menggunakan komposisi fase gerak yang berubah-ubah (polaritas berubah) selama proses kromatografi berlangsung 2 HPLC-2011

3 Teknik Isokratik 3 HPLC-2011

4 Eluen= campuran A + B 50 % B 40 % B 4 HPLC-2011

5 30 % B 35 % B 5 HPLC-2011

6 Teknik Gradien Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas, kemudian dilakukan teknik elusi gradien 6 HPLC-2011

7 Hasilnya 7 HPLC-2011

8 Normal-Phase HPLC [ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ] Senyawa polar: - terelusi belakangan (t R panjang) - semakin non-polar fase gerak, t R senyawa polar makin panjang Solven: - campuran metilen klorid, dietileter, kloroform Eluent strength: - dimodifikasi dengan n-heksan 8 HPLC-2011

9 Reversed-Phase HPLC Reversed-Phase HPLC [ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ] Senyawa polar: - terelusi lebih dahulu Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar lebih kuat tertahan Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetrahidrofuran Eluent strength: - dimodifikasi dengan air (Kellner dkk., 1998) 9 HPLC-2011

10 Perkirakan urutan elusi, dari pertama sampai terakhir, pada steroid-steroid berikut ini dari kolom ODS dg fase gerak metanol/air (70:30) Nandrolone Methyltestosterone

11 Detektor Bagaimana Memilih detektor dan Apa pertimbangannya???

12 Detektor HPLC Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

13 Detektor HPLC Bulk property detector (BPD) : - mengukur sifat solute dan fase gerak contoh : detektor indeks bias ( RI ) Solute property detector (SPD) : - hanya mengukur sifat solute kali sensitif dibanding BPD Contoh : detektor UV

14 Syarat Detektor : Cukup sensitif Stabilitas dan reprodusibilitas tinggi Respon linear terhadap solut Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung flow rate (kec.alir) Mudah digunakan Tidak merusak sampel

15 Detektor UV Detektor ini bekerja pada λ tertentu dimana pelarut tidak menyerap sinar pada λ tersebut sedangkan sampel menyerap dengan kuat. Ada dua jenis detektor UV : detektor dengan satu panjang gelombang (254 nm) dan detektor dengan λ yg dapat diubah-ubah antara nm Detektor mempunyai jangka kepekaan yg lebar Detektor ini hanya bekerja jika senyawa mempunyai kromofor

16

17 Kromofor UV-HPLC

18 Kromofor UV-HPLC

19 Detektor UV Untuk keperluan analisis komponen utama dalam sampel secara HPLC-UV diperlukan minimal nilai senyawa harus 10 M -1. cm -1 pada 185 nm. Untuk keperluan trace analisis secara HPLC- UV diperlukan minimal nilai senyawa harus 1000 M -1. cm -1 Untuk trace analisis secara HPLC deteksi UV, senyawa dengan nilai senyawa 100 M -1. cm -1 tidak mungkin dilakukan

20

21 UV / Visible detector Advantages High sensitivity & small sample volume required Can be used with gradient elution Is relatively cheap and not sensitive to temperature Sensitive to large number of organic compounds Disadvantages Does not work with compounds that do not absorb light at this wavelength region Cannot be used with the solvents having large absorption in the UV region Cannot be used for the sample components which cannot be absorbed in the UV region 21

22

23 Detektor PDA Mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yg berbeda dlm sekali proses (single run) Pada kromatogram dapat pula ditampilkan spektrum UV shg dpt digunakan untuk memilih λmaks utk sistem HPLC Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan ditampilkan sbg plot 3 dimensi (absorbansi, panjang gelombang, dan waktu)

24

25 Detektor Fluoresensi Merupakan detektor yg paling peka, tetapi hanya dapat dipakai untuk senyawa yg bisa berfluorisensi, karena itu kadang2 solut diubah menjadi turunan senyawa yg berfluorisensi sebelum dikromatografi

26 Detektor UV vs Fluorescen UV Fluorescen 26 HPLC-2011

27 Luminescence Bagaimana terjadinya fluorescensi??? Fluorescensi 27 HPLC-2011

28 Fluorescene detection Compared to UV-VIS detectors fluorescence detectors offer a higher sensitivity and selectivity that allows to quantify and identify compounds and impurities in complex matrices to extremely low concentration levels (trace level analysis) Fluorescence detectors sense only those substances that fluoresce excitation Mobile phase emission suwedo hadiwiyoto basic principles of HPLC

29 Derivatisasi Apa arti derivatisasi? Apa tujuannya? Bagaimana caranya? Derivatisasi Post-/Pre-column? HPLC

30 Tujuan Derivatisasi Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa dengan pereaksi (agen) penderivat untuk menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa nonkromofor senyawa berkromofor) Meningkatkan daya deteksinya (senyawa berkromofor UV senyawa berkromofor fluorescensi) 30 HPLC-2011

31 Syarat reaksi derivatisasi 1. Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar UV-Vis atau membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; 2. Proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); 3. Produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; 4. Sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak menganggu pemisahan kromatografi.

32 Captopril HS CH 3 O N COOH Dapatkah Captopril dianalisis secara HPLC dengan detektor UV? 32 HPLC-2011

33 Derivatisasi dg p-br fenacylbromide HS CH 3 O O N COOH + Br C-CH 2 -Br Captopril E t i l a m i n p -Br fenacylbromide 33 HPLC-2011

34 Hasil derivatisasi : Captopril + p -Br Fenacylbromide HS CH 3 O N O O C-O-CH 2 -C Br Dapat dideteksi secara UV 34 HPLC-2011

35 Gabapentin H 2 N C O OH R-NH 2 Dapatkah Gabapentin dianalisis secara HPLC dengan detektor UV atau Fluorescen? 35 HPLC-2011

36 Derivatisasi dg Dansilklorid H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 N N + R-NH 2 - HCl O=S=O Cl O=S=O NH Dansil klorid Fluorescent derivative HPLC R

37 Contoh Senyawa Asli Yang Berfluorescensi

38 Kunang-kunang 38 HPLC-2011

39 Fluorescensi 39 HPLC-2011

40 Asam Salisilat O C OH O H

41 As.Salisilat - Fluorescensi O C OH O H

42 Papaverin HCl H 3 CO H 3 CO N OCH 3.HCl CH 2 OCH 3

43 Riboflavin OH OH OH CH 2 -CH-CH-CH-CH 2 OH H 3 C N N O H 3 C N NH O

44 44 HPLC-2011

45 Detektor Indeks Bias Indeks bias solut dan pelarut harus berbeda Detektor mengukur perbedaan antara indeks bias pelarut murni dan indeks bias pelarut yg keluar dari kolom, perbedaan ini disebabkan oleh adanya solut. Detektor ini tidak dapat dipakai untuk elusi bergradien karena indeks bias sistem berubah selama kromatografi Sangat sensitif terhadap perubahan suhu

46 Refractive index (RI) detection The ability of a compound or solvent to deflect light provides a way to detect it The RI is a measure of molecule s ability to deflect light in a flowing mobile phase in a flow cell relative to a static mobile phase contained in a reference flow cell The amount of deflection is proportional to concentration The RI detector is considered to be a universal detector but it is not very sensitive basic principles of HPLC

47 Detektor Elektrokimia Detektor ini menggunakan sifat redoks solut untuk mengukur kehadiran solut tersebut. Memiliki kepekaan yg tinggi Fase gerak harus polar dan mengandung elektrolit pendukung

48 Detektor Spektrometri Massa Untuk identifikasi senyawa murni GC-MS : terjadi pola fragmentasi LC-MS : tdk terjadi pola fragmentasi Data berupa berat molekul, terkadang ditambah berat molekul pelarut

49 Bentuk Kromatogram Bentuk kromatogram (peak) ada bermacam-macam, a.l: - tailing, fronting (leading) - asimetri, simetri - pecah - lainnya 49 HPLC-2011

50 Peak Tailing Peak Fronting Possible cause: Possible solution: Possible cause: Possible solution: Dead volume in flow path Mobile phase too weak Check all fittings, especially postcolumn and at the column head Remake mobile phase or increase acid concentration Overloading of column Column is poorly packed Dilute sample 1:10 and rerun or use a larger capicity column Run high organic through column, then equilibrate and retry, or replace column

51 Peak asymmetry - tailing USP HPLC

52 Peak Asymmetry vs Tailing Baca: Snyder dkk., 1997 HPLC

53

54 Kriteria Peak HPLC

55 Pengatasan Peak Tailing Tambahkan 30 mm: - Trietilamin (utk seny. basa) - Amonium asetat (utk seny. asam) Bila Tailing masih tetap ada, gantilah trietilamin dengan: 10 mm dimetiloktilamin atau dimetiloktilamin asetat Kurangi jumlah sampel hingga < 1 g Bagaimana mekanisme kerja TEA mencegah tailing? 55 HPLC-2011

56 Tailing Senyawa Basa Pada RP-HPLC, residu silanol [ Si-OH ] dalam kolom yang bersifat asam, akan berikatan kuat dengan senyawa basa [ R-NH 2 ] yang melewati kolom tersebut. Agar tidak terjadi tailing, ditambahkan amin modifier ke dalam campuran fase gerak, misal: trietilamin [ TEA ]. TEA akan me-masking residu Si-OH, sehingga saat senyawa basa melewati kolom tidak terjadi ikatan yang terlalu kuat, hingga akhirnya dapat memperkecil terjadinya tailing. 56 HPLC-2011

57 Penggunaan TEA Perhatikan jumlahnya, jangan terlalu banyak. Bila terlalu banyak akan menghilangkan fungsi residu silanol pada kolom RP-18. Untuk hal tersebut, lakukan optimasi! Perhatikan: pencucian kolom sesudah digunakan pemisahan dengan fase gerak yang mengandung TEA 57 HPLC-2011

58 Broad Peaks Possible cause: Overloading of column Retention time too long Extra-column volume too large Possible solution: Dilute sample 1:10 and rerun Modify gradient so that peaks elute earlier Reduce tubing diameters and lengths where possible, particularly postcolumn "Dead" volume Detector time too slow Check all connections for proper fit Increase detector Hz rate

59 Peak Doubling Possible cause: Overloading of column Sample volume too large Dead volume in flow path Problems internal to column Clogged sample filter Possible solution: Dilute sample 1:10 and rerun or use a higher capacity column Inject less than 1/6 of the column volume, or increase sample concentration Check all fittings, in particular post-column and at the column head Run high organic through column, equilibrate and retry, or replace column Replace filter

60 Jenis-Jenis HPLC

61 Kromatografi Adsorpsi Pemisahan menggunakan fase normal Sering terjadi tailing Fase gerak dimodif dengan penambahan pelarut polar (air, metanol, etanol) Detektor UV lazim digunakan

62 Kromatografi Partisi Pemisahan menggunakan fase terbalik Pemisahan dilakukan untuk senyawa2 yg bersifat asam lemah atau basa lemah Fase gerak harus dijaga ph-nya dengan buffer agar analit tidak terionisasi

63 Kromatografi Penukar Ion Fase diam dapat menukar kation atau anion dg fase gerak Fase gerak mengandung air untuk proses ionisasi Retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh ph fase gerak

64 Kromatografi Eksklusi Ukuran Prinsip pemisahan berdasarkan ukuran molekul fase gerak Digunakan untuk memisahkan senyawa dg BM>2000 dalton Fase diam berupa silika atau polimer yg bersifat porus