T E S I S. Oleh S U P A R N I /BM L A H PA S C A S A R J A N A SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2009

Transkripsi

1 PENGARUH PEMBERIAN VITAMIN C TERHADAP JUMLAH SPERMA DAN MORFOLOGI SPERMA MENCIT JANTAN DEWASA (Mus musculus, L.) YANG DIPAPARKAN MONOSODIUM GLUTAMATE (MSG) T E S I S Oleh S U P A R N I /BM S E K O L A H PA S C A S A R J A N A SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2009

2 PENGARUH PEMBERIAN VITAMIN C TERHADAP JUMLAH SPERMA DAN MORFOLOGI SPERMA MENCIT JANTAN DEWASA (Mus musculus, L.) YANG DIPAPARKAN MONOSODIUM GLUTAMATE (MSG) T E S I S Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Magister Kesehatan dalam Program Studi Ilmu Biomedik pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara Oleh S U P A R N I /BM SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2009

3 Judul Tesis : PENGARUH PEMBERIAN VITAMIN C TERHADAP JUMLAH SPERMA DAN MORFOLOGI SPERMA MENCIT JANTAN DEWASA (Mus musculus, L.) YANG DIPAPARKAN MONOSODIUM GLUTAMATE (MSG) Nama Mahasiswa : Suparni Nomor Pokok : Program Studi : Biomedik Menyetujui Komisi Pembimbing (Dr. Drs. Syafruddin Ilyas, M.Biomed) Ketua (dr. Dedi Ardinata, M.Kes, AIFM) Anggota Ketua Program Studi, Direktur, (dr. Yahwardiah Siregar, PhD) (Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc) Tanggal lulus: 29 Agustus 2009

4 Telah diuji pada Tanggal: 29 Agustus 2009 PANITIA PENGUJI TESIS Ketua : Dr. Drs. Syafruddin Ilyas, M.Biomed Anggota : 1. dr. Dedi Ardinata, M.Kes, AIFM 2. Prof. Em. dr. Yasmeini Yazir 3. Prof. dr. Gusbakti Rusip, MSc, PKK

5 ABSTRAK Monosodium Glutamate (MSG) menyebabkan terjadinya penurunan jumlah sperma yang bentuknya normal dan peningkatan jumlah sperma yang bentuknya abnormal. MSG akan menimbulkan terjadinya stress oksidatif yang ditandai dengan terbentuknya radikal bebas. Vitamin C berfungsi sebagai antioksidan dengan cara menetralisir radikal bebas dan menghambat peroksidasi lipid. Pemberian vitamin C mencegah penurunan jumlah sperma dan menurunkan bentuk sperma yang abnormal. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui bagaimana pengaruh pemberian vitamin C terhadap jumlah sperma dan morfologi sperma mencit jantan dewasa (Mus musculus, L.) yang ditimbulkan oleh pemberian MSG. Subjek penelitian adalah mencit jantan dewasa (Mus musculus, L.) strain DD Webster dewasa fertil berumur ± 3 bulan dengan berat badan gram, sebanyak 25 ekor yang di bagi dalam 5 kelompok perlakuan masing-masing terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa. Kelompok pertama sebagai kontrol negatif yang diberi dengan NaCl 0,9 % 0,5 ml selama 30 hari, kelompok ke-dua kontrol positif diberi MSG 4 mg/g bb intraperitoneal (IP) dilarutkan dengan NaCl 0,9 % 0,5 ml selama 15 hari, 15 hari berikutnya diberi NaCl 0,9% 0,5 ml, kelompok ke-tiga diberi MSG 4 mg/g bb (IP) selama 30 hari, kelompok keempat diberi MSG 4 mg/g bb 15 hari pertama dan dilanjutkan dengan pemberian vitamin C 0,2 mg/g bb oral 15 hari berikutnya, kelompok ke-lima diberi MSG 4 mg/g bb (IP) 15 hari pertama dilanjutkan dengan pemberian MSG 4 mg/g bb ditambah vitamin C 0,2 mg/g bb 15 hari berikutnya. Penelitian ini telah mendapat persetujuan dari komite etik penelitian USU. Pemeriksaan jumlah sperma dilakukan dengan menggunakan kamar hitung Improved Neubauer dan pemeriksaan morfologi sperma dibuat sediaan hapusan yang diwarnai dengan Giemsa. Diperoleh hasil bahwa pemberian MSG 4 mg/g bb dan vitamin C 0,2 mg/g bb terdapat perbedaan jumlah sperma dan terdapat perbedaan rata-rata persentase morfologi sperma normal pada tiap kelompok perlakuan tetapi tidak menunjukkan hasil yang bermakna (p>0,05), hal ini menunjukkan jumlah sperma dan morfologi sperma normal tidak dipengaruhi oleh pemberian MSG dan vitamin C secara tersendiri maupun bersamaan pada perlakuan. Kata Kunci: MSG, Vitamin C, Sperma.

6 ABSTRACT Monosodium glutamate (MSG) decreased normal sperm count and increased abnormal sperm count. MSG caused stress oxidative by formation of free radicals. Vitamin C as an antioxidant by neutralizing free radicals and prevent lipid peroxidation. Intake vitamin C prevents decreased normal sperm and increased abnormal sperm count. The aim of this study is to investigate the effect of intake vitamin C to sperm count and sperm morphology of adult male mice (Mus musculus, L.) which is exposed MSG. Subject of this study was 25 adult male mice (Mus Musculus, L) strain DD Webster fertile, age ±3 months old, body weight gram and divided 5 groups. The first group, as negative control which is given 0,5 ml of NaCl 0,9% intraperitoneal (IP) for 30 days. The second group, as a positive control which is given MSG 4 mg/g BW (IP) for 15 days, then the next 15 days, the mice is given 0,5 ml of NaCl 0,9%. The third group is given MSG 4 mg/g BW (IP) for 30 days. The fourth group is given MSG 4 mg/g BW for 15 days and 15 days later they are given orally o,2 mg/g BW of vitamin C. The fifth group is given MSG 4 mg/g BW (IP) for 15 days and 15 days later the mice is given MSG 4 mg/g BW (IP) and orally 0,2 mg/g BW of vitamin C. All the experimental procedures and animal maintenance confirmed to the strict guidelines of institutional animal ethics committee USU. The sperm count using Improved Neubauer counting chamber and the morphology of the sperm using Giemsa smear. The result of injection MSG 4 mg/g BW and supplement vitamin C 0,2 mg/g BW is the difference of sperm count and mean of normal sperm morphology percentage in each groups but not significant (p>0,05), that means sperm count and normal sperm morphology is not affected by MSG and vitamin C, combined or separated, in each groups. Keywords: MSG, Vitamin C, Sperm.

7 KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah swt, atas limpahan berkat dan karunianya, sehingga penulis dapat menyelesaikan Tesis ini dengan judul Pengaruh Pemberian Vitamin C terhadap Jumlah Sperma dan Morfologi Sperma Mencit Jantan Dewasa (Mus musculus, L.) yang Dipaparkan Monosodium Glutamate (MSG) sebagai salah satu syarat dalam menyelesaikan jenjang pendidikan strata 2 pada Program Studi Biomedik Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara. Proses penulisan tesis ini tidak terlepas dari bimbingan, bantuan, dukungan dan do a dari berbagai pihak, pada kesempatan ini ucapkan terima kasih saya sampaikan kepada yang terhormat: 1. Prof. Chairuddin P. Lubis, DTM&H, Sp.A(K), Rektor Universitas Sumatera Utara. 2. Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, MSc, Direktur Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara. 3. dr. Yahwardiah Siregar, PhD, Ketua Program Studi Biomedik Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara. 4. Dr. Drs. Syafruddin Ilyas, M.Biomed, Ketua Komisi Pembimbing yang senantiasa bersedia meluangkan waktu untuk membimbing, memberikan masukan dan pemikiran dengan penuh kesabaran kepada penulis untuk menyelesaikan tesis ini. 5. dr. Dedi Ardinata, S.Ked, M.Kes, Anggota Komisi Pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan transfer ilmu, masukan serta dukungan yang diberikan untuk penyelesaian tesis ini. 6. Prof. Em. dr. Yasmeini Yazir, Dosen Pembanding yang telah memberikan masukkan mulai dari usulan penelitian hingga penyelesaian tesis ini. 7. Prof.dr. Gusbakti Rusip, MSc, PKK, Dosen Pembanding yang juga banyak memberikan masukan untuk perbaikan tesis ini.

8 8. Seluruh Dosen Program Studi Biomedik Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara, yang telah memberikan pembelajaran dan selama penulis mengikuti pendidikan. 9. Ir. Zuraidah Nasution, M.Kes, Direktur Politeknik Kesehatan Medan yang telah memberi kesempatan kepada penulis untuk melanjutkan pendidikan strata 2 di Program Studi Biomedik Pascasarjana Universitas Sumatera Utara. 10. dr. Fachri Nasution, DAN, Ketua Jurusan Analis Kesehatan Politeknik Kesehatan Medan yang telah memberi dukungan kepada penulis untuk melanjutkan pendidikan strata 2 di Program Studi Biomedik Pascasarjana Universitas Sumatera Utara. Kepada Ibunda Almarhummah dan Ayahanda, ananda mengucapkan terima kasih tak terhingga atas kasih sayang serta dukungannya. Kepada suamiku tercinta Ir. Agustin, terima kasih atas pengertian, perhatian dan dukungan semangat, serta anakanakku tersayang (Gusni Rahmah dan Muhammad Yusuf) yang selama dua tahun ini banyak waktu bersama yang terlewatkan, menjadi inspirasi untuk dapat menyelesaikan pendidikan ini. Kepada teman-teman Biomedik seangkatan 2007, terima kasih atas bantuan morilnya, kalian adalah teman-temanku yang terbaik. Medan, Agustus 2009 Penulis Suparni

9 RIWAYAT HIDUP 1. Nama : Suparni 2. Tempat/Tanggal lahir : Tanjung Morawa/25 Agustus Agama : Islam 4. Status : Menikah 5. Alamat : Dusun I Gg Rame Desa Telaga Sari Tanjung Morawa 6. Telepon/Hp : Pendidikan : SD Negeri Tanjung Morawa Tahun SMP Bersubsidi Tanjung Morawa Tahun SMAK Depkes RI Medan Tahun Sarjana (S1) Fakultas Biologi UMA Tahun Sekolah Pasacasarjana, Program Biomedik, USU Tahun Riwayat Pekerjaan : Guru SMAK Depkes RI Medan Tahun Dosen AAK Depkes RI Medan Tahun Dosen Politeknik Kesehatan Depkes Medan Tahun 2001-Sekarang

10 DAFTAR ISI Halaman ABSTRAK... i ABSTRACT... ii KATA PENGANTAR... iii RIWAYAT HIDUP... v DAFTAR ISI... vi DAFTAR TABEL... viii DAFTAR GAMBAR... ix DAFTAR LAMPIRAN... x BAB I PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Landasan Teori Tujuan Penelitian Hipotesis Manfaat Penelitian... 7 BAB II TINJAUAN PUSTAKA Monosodium Glutamate (MSG) Vitamin C Fisiologi Reproduksi Mencit Jantan BAB III METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Variabel Penelitian Definisi Operasional Bahan dan Alat Penelitian Disain Penelitian... 24

11 3.6 Pelaksanaan Penelitian Analisa Data dan Pengujian Hipotesis Jadwal Penelitian BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Penelitian Pembahasan BAB V KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA... 40

12 DAFTAR TABEL Nomor Judul Halaman 3.1. Jadwal Penelitian Pengamatan Berat Badan Awal dan Akhir Mencit Jantan Dewasa Jumlah Sperma Di Dalam Suspensi Cauda Epididimis Mencit Jantan Dewasa Morfologi Sperma Normal di dalam Suspensi Cauda Epididimis Mencit Jantan Dewasa... 34

13 DAFTAR GAMBAR Nomor Judul Halaman 1.1. Landasan Teori Kamar Hitung Improved Neubauer Morfologi Sperma Vas Deferen Mencit (Washington et al., 1983) Gambar A adalah Sperma Normal, dengan Kepala Seperti Kait Pancing, Gambar B, C dan D adalah Sperma Abnormal (B = Sperma dengan Kepala Seperti Pisang, C = Sperma Tidak Beraturan, dan D = Sperma Terlalu Bengkok) Grafik Berat Badan Awal Dan Berat Badan Akhir Grafik Jumlah Sperma Grafik Morfologi Sperma Normal Morfologi Spermatozoa Mencit (Mus musculus, L) Strain DD Webster, Gambar a = Sperma Normal, dengan Kepala Seperti Kait Pancing dan Ekor Lurus, Gambar b, c dan d = Sperma Abnormal (b = Sperma dengan Dua Kepala, c = Ekor Sperma Melingkari Kepala, d = Ekor Sperma Membengkok)... 36

14 DAFTAR LAMPIRAN Nomor Judul Halaman 1. Surat Ethical Clearence Surat Keterangan tentang Hewan Mencit (Mus musculus L.) dari LPPT- UGM Hasil Uji Statistik Berat Badan Awal dan Berat Badan Akhir Mencit Jantan Dewasa Hasil Uji Statistik Jumlah Sperma Mencit Jantan Dewasa Hasil Uji Statistik Morfologi Sperma Normal Mencit Jantan Dewasa Dokumentasi Penelitian... 58

15 BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Monosodium glutamate (MSG) sudah lama digunakan di seluruh dunia sebagai penambah rasa makanan dengan L-Glutamic acid sebagai komponen asam amino (Geha et al., 2000), disebabkan penambahan MSG akan membuat rasa makanan menjadi lebih lezat (Loliger, 2000). Adapun rata-rata asupan MSG per hari pada masyarakat di negara industri sekitar 0,3-1,0 g, tetapi adakalanya bisa menjadi lebih tinggi tergantung pada jenis makanan dan pilihan rasa seseorang (Geha et al., 2000). Asupan MSG terbanyak dijumpai pada masyarakat Korea yang mencapai 1,6 g/hari (Loliger, 2000), sedangkan di Indonesia sekitar 0,6 g per hari. Di Amerika Serikat, Food and Drugs Administration (FDA, 1995) mengkategorikan MSG sebagai bahan yang aman untuk dikonsumsi dan Prawirohardjono et al (2000) melaporkan tidak ada perbedaan gejala yang bermakna antara kelompok orang sehat yang mengkonsumsi kapsul MSG 1,5 g per hari selama tiga hari, kelompok orang sehat yang mengkonsumsi kapsul MSG 3 g per hari selama tiga hari dan kelompok plasebo. Tetapi, ada laporan yang menyatakan asupan MSG dalam jumlah besar menimbulkan beberapa gejala pada orang yang sensitif seperti kebas pada belakang leher yang berangsur-angsur menjalar ke lengan dan punggung, badan lemah dan jantung berdebar, gejala-gejala ini dikenal sebagai Chinese restaurant syndrome (Geha et al., 2000).

16 Olney (1969) mendapati penyuntikan MSG secara subkutan pada mencit baru lahir menimbulkan terjadinya nekrosis akut neuron pada beberapa bagian otak yang sedang berkembang termasuk hipotalamus, yang ketika dewasa mencit tersebut mengalami kekerdilan tulang rangka, obesitas dan sterilitas pada mencit betina. Penelitian terhadap mencit jantan dewasa yang disuntikkan MSG secara subkutan selama 6 hari dengan dosis 4 mg/g berat badan dan 8 mg/g berat badan menyebabkan peningkatan kadar glukosa eritrosit, peningkatan kadar peroksidasi lipid, kadar total glutation dan protein yang terikat glutation serta peningkatan aktivitas enzim glutathione reductase (GR), glutathione-s-transferase (GST) dan glutathione peroxidase (GPX). Hal ini menggambarkan bahwa dengan pemberian MSG 4 mg/g berat badan mengakibatkan terjadinya stress oksidatif yang diantisipasi tubuh dengan meningkatkan kadar glutation dengan cara meningkatkan aktivitas enzim metaboliknya (Ahluwalia et al., 1996). Pemberian MSG 4 g/kg berat badan secara intraperitoneal pada tikus Wistar jantan dewasa selama 15 hari (paparan jangka pendek) dan 30 hari (paparan jangka panjang) memperlihatkan terjadinya penurunan berat testis, penurunan jumlah sperma yang bentuknya normal dan peningkatan jumlah sperma yang bentuknya abnormal, penurunan kadar asam askorbat di dalam testis dan peningkatan kadar peroksidasi lipid di dalam testis. Pada kelompok paparan jangka pendek memperlihatkan penurunan jumlah sperma yang bentuknya normal lebih rendah dan peningkatan jumlah sperma dengan ekor abnormal lebih besar serta kerusakan oksidatif lebih besar bila dibandingkan dengan kelompok paparan jangka panjang (Nayanatara et al., 2008, Vinodini et al., 2008).

17 Pemberian vitamin C secara oral dengan dosis mg/hari pada lakilaki infertil meningkatkan jumlah sperma secara in vivo. Vitamin C merupakan antioksidan mampu menetralisir hidroksil, superoksid, dan radikal peroksidasi hidrogen dan mencegah aglutinasi sperma (Agarwal et al., 2005). Penelitian yang dilakukan pada testis tikus yang dipaparkan Cadmium (Cd) 10 mg/g berat badan memperlihatkan bahwa pemberian vitamin C 10 mg/kg berat badan secara intraperitoneal mampu mengurangi kadar MDA dalam testis dan peningkatan jumlah sperma disertai penurunan persentase sperma yang berbentuk abnormal, pada pemberian vitamin E 100 mg/kg berat badan secara intraperitoneal memperlihatkan efek yang mirip pada pemberian vitamin C, akan tetapi efek dari vitamin E lebih rendah (Acharya et al., 2006). Penelitian yang dilakukan pada kelinci usia 5 bulan yang diberi suplemen vitamin C 1,5 g/l dan vitamin E 1 g/l pada minumannya dan kombinasi vitamin C ditambah vitamin E (1,5 g/l+1 g/l) selama 12 minggu memperlihatkan penurunan kadar thiobarbituric acid-reactive di dalam cairan semen serta peningkatan libido (waktu reaksi), volume ejakulasi, konsentrasi sperma, jumlah sperma yang dikeluarkan, indeks motilitas sperma, total sperma yang bergerak, volume sperma, konsentrasi ion hidrogen (ph), dan konsentrasi fruktosa semen serta penurunan jumlah sperma bentuk abnormal dan sperma yang mati dan peningkatan kadar glutathione S-transferase (GST) di dalam cairan semen (Yousef et al., 2003). Pemberian vitamin C 0,2 mg/g berat badan secara oral selama 36 hari pada mencit jantan mampu berperan sebagai antioksidan untuk melindungi efek senyawa

18 radikal bebas yang ditimbulkan oleh senyawa Plumbum asetat 0,1% yang ditandai oleh berkurangnya kadar malondialdehyde di dalam sekresi epididimis (Fauzi, 2008). Penelitian terhadap pasien infertil dengan keadaan oligosperma, motilitas sperma rendah dan jumlah sperma bentuk normal yang rendah, setelah diberikan suplemen vitamin C 1000 mg per hari selama 2 bulan, memperlihatkan peningkatan jumlah sperma, motilitas sperma dan jumlah sperma yang morfologinya normal (Akmal et al., 2006). Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh oleh Nayanatara (2008) akan pengaruh pemberian MSG dapat menimbulkan terjadinya stress oksidatif pada testis tikus Wistar dan penelitian-penelitian yang lain akan efek pemberian vitamin C sebagai antioksidan terhadap testis. Maka penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian vitamin C terhadap jumlah sperma dan morfologi sperma pada mencit jantan dewasa (Mus musculus, L) yang telah dipaparkan dengan MSG Perumusan Masalah Bagaimana pengaruh pemberian vitamin C terhadap jumlah sperma dan morfologi sperma mencit jantan dewasa (Mus musculus, L.) akibat yang ditimbulkan oleh pemberian Monosodium glutamate (MSG) Landasan Teori Pemberian MSG dengan dosis 4 mg/g berat badan akan menimbulkan terjadinya stress oksidatif pada mencit yang ditandai dengan terbentuknya radikal

19 bebas yang akan dilawan oleh tubuh mencit cara meningkatkan aktivitas enzim glutathione reductase (GR), glutathione-s-transferase (GST), glutathione peroxidase (GPX) yang berfungsi untuk meningkatkan produksi glutathion yang merupakan anti oksidan. Radikal bebas yang terbentuk tersebut juga menimbulkan terjadinya proses peroksidasi lipid yang ditandai dengan peningkatan kadar malondialdehyde (MDA). Hal ini kemudian akan menyebabkan penurunan kadar asam askorbat di dalam testis yang berakibat terhadap penurunan jumlah sperma. Oleh karena vitamin C dapat bersifat sebagai antioksidan dengan cara menetralisir radikal bebas dan menghambat peroksidasi lipid, maka diharapkan dengan pemberian vitamin C dapat menghambat terjadinya peroksidasi lipid, mencegah penurunan kadar asam askorbat dalam testis dan mencegah penurunan jumlah sperma.

20 MSG 4 mg/g b b secara intraperioneal MSG 4 mg/g b b secara intraperitoneal Radikal bebas (Stress oksidatif) Radikal bebas (Stress oksidatif) Vitamin C 0,2 mg/g bb secara oral Glutathione reductase(gr) Glutathione-Stransferase(GST) Glutathione peroxidase(gpx) Peroksidasi lipid Kadar asam askorbat dalam testis Peroksidasi lipid Kadar asam askorbat dalam testis Glutathione Jumlah sperma Morfologi sperma Jumlah sperma? Morfologi sperma? Gambar 1.1. Landasan Teori

21 1.4. Tujuan Penelitian Tujuan Umum Untuk mengetahui bagaimana pengaruh pemberian vitamin C terhadap jumlah sperma dan morfologi sperma mencit jantan dewasa (Mus musculus, L.) akibat yang ditimbulkan oleh pemberian Monosodium glutamate (MSG) Tujuan khusus a. Untuk mengetahui pengaruh pemberian vitamin C terhadap jumlah sperma mencit jantan dewasa yang dipaparkan MSG. b. Untuk mengetahui pengaruh pemberian vitamin C terhadap morfologi sperma mencit jantan dewasa yang dipaparkan MSG Hipotesis Ho : a. Tidak ada pengaruh pemberian vitamin C terhadap peningkatan jumlah sperma mencit jantan dewasa yang dipaparkan MSG. b. Tidak ada pengaruh pemberian vitamin C terhadap peningkatan morfologi normal sperma mencit jantan dewasa yang dipaparkan MSG. Ha : a. Ada pengaruh pemberian Vitamin C terhadap peningkatan jumlah sperma mencit jantan dewasa yang dipaparkan MSG. b. Ada pengaruh pemberian Vitamin C terhadap peningkatan morfologi normal sperma mencit jantan dewasa yang dipaparkan MSG.

22 1.6. Manfaat Penelitian 1. Dijadikan bahan pertimbangan kepada masyarakat dan pemerintah untuk memperhatikan penggunaan MSG dalam kehidupan sehari-hari. 2. Bisa dijadikan referensi untuk penelitian selanjutnya akan dampak konsumsi MSG terhadap fungsi sistem reproduksi.

23 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Monosodium Glutamate (MSG) Sejarah Penemuan MSG MSG ditemukan pertama kali oleh Ikeda pada tahun 1909 dari mengisolasi garam metalik asam glutamat dari tumbuhan laut (genus Laminaria) atau disebut konbu di Jepang (Halpern, 2002), memiliki cita rasa yang khas disebut umami suatu elemen rasa yang dijumpai pada makanan alamiah seperti kaldu. Karakteristik umami berbeda dengan empat rasa yang lain pahit, manis, asin dan asam, berupa sedap, lezat atau enak (Loliger, 2000), rasa umami ini bertahan lama dan di dalamnya terdapat komponen L-glutamate (suatu asam amino non esensial) dan 5 -ribonucleotide (Yamaguchi dan Ninomiya, 2000). MSG banyak digunakan pada masakan Cina dan Asia Tenggara yang dikenal dengan nama Ajinomoto, Sasa, Vetsin, Miwon atau Weichaun (Geha et al., 2000) Sifat Kimia dan Metabolisme MSG MSG bersifat sangat larut dalam air (Geha et al., 2000), glutamat yang terdapat dalam MSG merupakan suatu asam amino yang banyak dijumpai pada makanan, kandungan glutamat 20% dari total asam amino pada beberapa makanan baik bebas maupun terikat dengan peptida ataupun protein (Garattini, 2000). Sementara glutamat yang terdapat di dalam MSG dan yang berasal dari hidrolisa protein tumbuhan merupakan glutamat dalam bentuk bebas. Konsumsi glutamat

24 bebas akan meningkatkan kadar glutamat dalam plasma darah (Gold, 1995). Selanjutnya glutamat di dalam mukosa usus halus akan diubah menjadi alanin dan di dalam hati akan diubah menjadi glukosa dan laktat. Adapun kadar puncak glutamat yang dicapai hewan dewasa setelah konsumsi oral 1 g/kg berat badan, kadar terendah dijumpai pada kelinci dan meningkat secara progesif pada monyet, anjing, mencit, tikus dan marmut. Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi kadar puncak asam glutamat plasma adalah rute pemberian (oral<subkutan<intraperitoneal), konsentrasi MSG dalam larutan (2%, 10%), dan usia (hewan baru lahir memetabolisme asam glutamat lebih rendah dari pada dewasa) (Garattini, 2000). Berikut rumus kimia MSG (Loliger, 2000): Diperkirakan seorang dengan berat badan 70 kg setiap harinya dapat memperoleh asupan asam glutamat sekitar 28 g yang berasal dari makanan dan hasil pemecahan protein dalam usus. Pertukaran asam glutamat setiap harinya dalam tubuh sekitar 48 g. Tapi jumlahnya dalam darah sedikit sekitar 20 mg karena kecepatannya mengalami ekstraksi dan penggunaan oleh beberapa jaringan termasuk otot dan hati (Garattini, 2000). Glutamat merupakan suatu neurotransmitter yang penting untuk komunikasi antar neuron, jika berlebihan akan dipompakan kembali ke dalam sel glial sekitar neuron, dan akan menyebabkan neuron tersebut mati (Gold, 1995, Garattini, 2000).

25 Glutamat akan membuka saluran kalsium neuron sehingga kalsium masuk ke dalam sel. Reaksi kimia yang berlangsung dalam sel secepatnya melepaskan bahan-bahan kimiawi yang merangsang neuron yang berdekatan. Asam arakidonat merupakan salah satu hasil reaksi kimia yang akan bereaksi dengan enzim dan menghasilkan radikal bebas seperti radikal hidroksil (Gold, 1995) Efek Biologi MSG Normalnya MSG yang berlebihan tidak dapat melewati sawar darah otak, tetapi terdapat beberapa bagian di dalam otak yang tidak dilindungi sawar darah otak seperti hipotalamus, organ circumventricular, batang otak, kelenjar hipofise dan testosterone (Gold, 1995). Sehingga pemberian MSG secara suntikan subkutan pada mencit baru lahir dapat menimbulkan terjadinya nekrosis neuron akut pada otak termasuk hipotalamus yang ketika dewasa akan mengalami hambatan perkembangan tulang rangka, obesitas dan sterilitas pada betina (Olney, 1969). Terdapat adanya laporan akan timbulnya gejala yang tidak menyenangkan pada manusia setelah mengkonsumsi MSG seperti kebas pada belakang leher yang berangsur-angsur menjalar kedua lengan dan punggung, perasaan lemah dan jantung berdebar-debar (Stegink et al., 1981), sakit kepala, rasa terbakar, tekanan pada wajah dan nyeri dada (Schaumburg et al., 1969). Kumpulan gejala tersebut dikenal dengan istilah Chinese Restaurant Syndrome yang umumnya timbul setelah mengkonsumsi makanan Cina yang banyak mengandung MSG (Kenney, 1986). Penelitian terhadap tikus yang pada makanan standarnya ditambah MSG 100 g/kg berat badan/hari, setelah 45 hari memperlihatkan adanya disfungsi metabolik

26 berupa peningkatan kadar glukosa darah, triasigliserol, insulin dan leptin. Keadaan tersebut disebabkan terjadinya stress oksidatif berupa peningkatan kadar hiperperoksidasi lipid dan penurunan bahan-bahan antioksidan, tetapi hal tersebut dapat dicegah dengan penambahan serat pada makanan (Diniz et al., 2005). Begitu juga pemberian MSG 4 mg/g berat badan secara subkutan selama 10 hari pertama kelahiran kemudian dilakukan pemeriksaan pada hari ke-25 memperlihatkan peroksidasi lipid meningkat secara bermakna (Babu et al., 1994). Keadaan stress oksidatif juga dijumpai setelah pemberian MSG 4 mg/g berat badan secara intraperitoneal memperlihatkan peningkatan pembentukan MDA di hati, ginjal dan otak tikus. Pemberian makanan yang mengandung vitamin C, E dan quercetin secara bersamaan mengurangi kadar MDA yang muncul akibat pemberian MSG tersebut (Farombi dan Onyema, 2006). Penelitian terhadap tikus Sprague-Dawley baru lahir yang mengalami lesi nukleus arkuatus setelah penyuntikan MSG 4 g/kg berat badan secara subkutan pada hari ke 1, 3, 5, 7 dan 9, setelah 10 minggu memperlihatkan adanya plak aterosklerotik pada permukaan lumen dinding aorta, degenerasi endotelium, inti endotelium mengalami edema, adanya vesikel dengan berbagai ukuran pada jaringan subendotelium serta sel otot polos mengalami migrasi dari tunika media ke tunika intima melalui interna elastika yang robek. Juga disertai peningkatan kadar kolesterol total, low density lipoprotein (LDL), kadar nitic oxide berkurang sedangkan kadar high densitiy lipoprotein tidak berubah (Xiao-hong et al., 2007).

27 Efek MSG terhadap Fungsi Reproduksi Federation of American Societies for Experimental Biology (FASEB) juga melaporkan adanya dua kelompok orang yang cenderung mengalami kompleks gejala MSG, kelompok pertama orang yang tidak toleran terhadap konsumsi MSG dalam jumlah besar dan kelompok kedua orang dengan penyakit asma tidak terkontrol, orang-orang ini cenderung mengalami kompleks gejala MSG, perburukan gejala asma yang bersifat sementara setelah mengkonsumsi MSG dengan dosis antara 0,5 g sampai 2,5 g (FDA, 1995). Penelitian terhadap pasien infertil dengan keadaan oligosperma, motilitas sperma rendah dan jumlah sperma bentuk normal yang rendah, setelah diberikan suplemen vitamin C 1000 mg per hari selama 2 bulan, memperlihatkan peningkatan jumlah sperma, motilitas sperma dan jumlah sperma yang morfologinya normal (Akmal et al., 2006). Pada mencit baru lahir (usia 2 sampai 11 hari) yang disuntikkan MSG 4 mg/g berat badan secara subkutan menimbulkan terjadinya disfungsi sistem reproduksi jantan dan betina yang manifestasinya akan muncul pada usia dewasa berupa pada mencit betina menimbulkan kehamilan lebih sedikit dan ovarium lebih kecil dan pada mencit jantan menimbulkan penurunan berat testis (Pizzi et al., 1977, Miskowiak et al., 1993). Pemberian MSG 4 mg/g berat badan secara intraperitoneal pada tikus yang baru lahir selama 2 hari sampai usia 10 hari dan diperiksa pada usia pra pubertas dan dewasa, memperlihatkan pada usia pra pubertas terjadi hiperleptinemia, hiperadiposit,

28 dan peningkatan kadar kortikosteron, penurunan berat testis, jumlah sel sertoli dan sel leydig per testis, serta penurunan kadar Luteinizing Hormone (LH), Follicle Stimulating Hormone (FSH), Thyroid (T), dan Free T4 (FT4). Sementara pada saat dewasa memperlihatkan hiperleptinemia yang lebih tinggi dan penurunan kadar FSH dan LH lebih rendah tetapi kadar T dan FT4 normal, dan tidak tampak perubahan struktur testis (Miskowiak et al., 1993). Penelitian selanjutnya memperlihatkan bahwa salah satu mekanisme yang mungkin berperan dalam timbulnya efek toksik akibat pemberian MSG pada sistem reproduksi jantan mungkin diperantarai melalui efeknya dalam menurunkan kadar asam askorbat. Penelitian tersebut dilakukan terhadap tikus Wistar jantan dewasa yang disuntikkan MSG dengan dosis 4 g/kg berat secara intraperitoneal badan selama 15 hari (kelompok jangka pendek) dan selama 30 hari (kelompok jangka panjang), memperlihatkan berkurangnya berat testis, jumlah sperma, kadar asam askorbat dalam testis dan meningkatnya jumlah sperma yang bentuknya abnormal. Pada kelompok jangka pendek memperlihatkan penurunan jumlah sperma bentuknya normal dan peningkatan jumlah sperma dengan ekor abnormal secara bermakna ketika dibandingkan dengan kelompok jangka panjang. Kadar asam askorbat dalam testis menurun secara bermakna pada kelompok jangka pendek ketika dibandingkan dengan kelompok jangka panjang (Nayanatara et al., 2008). Penelitian lanjutan yang dilakukan Vinodini et al (2008) memperlihatkan bahwa MSG dengan dosis 4 g/kg berat badan secara intra peritoneal selain menimbulkan terjadinya penurunan berat testis dan kadar asam askorbat di dalam testis juga memperlihatkan peningkatan

29 kadar peroksidasi lipid dalam testis dan pada kelompok jangka pendek memperlihatkan kerusakan oksidatif yang lebih besar bila dibandingkan dengan kelompok jangka panjang Vitamin C Sejarah Penemuan Vitamin C Asam askorbat alami banyak terdapat pada buah-buahan seperti jeruk, jeruk lemon, semangka, strawberi, mangga dan nenas serta sayur-sayuran berwarna hijau seperti brokoli dan kembang kol (Padayatty et al., 2003). Hewan juga dapat memproduksi asam askorbat, dari glukosa-d atau galaktosa-d seperti pada tumbuhtumbuhan (Naidu, 2003). Akan tetapi manusia dan golongan primata lainnya, babi dan kelelawar pemakan buah tidak dapat mensintesa asam askorbat karena tidak memiliki enzim gluconolactone oxidase (Luck et al., 1995). Baik asam askorbat yang alami maupun sintetis memiliki rumus kimia yang identik dan tidak terdapat perbedaan aktivitas biologi maupun bioavailabilitasnya (Naidu, 2003) Sifat Kimia dan Metabolisma Vitamin C Vitamin C adalah asam xyloascorbat-l (asam askorbat, AA), dengan hasil oksidasi pertamanya asam dehidroaskorbat (dehydro AA) yang juga mempunyai aktivitas vitamin C (Hughes, 1973), bersifat larut dalam air dan labil serta berperan penting dalam biosintesa kolagen, karnitin dan berbagai neurotransmitter (Naidu, 2003). Asam askorbat adalah merupakan 6 karbon lakton yang disintesa dari glukosa yang terdapat dalam liver (Padayatty et al., 2003).

30 Asam askorbat merupakan donor elektron dan reducing agent karena dapat mendonorkan dua elektron dari dua ikatan antara karbon kedua dan ketiga dari 6 molekul karbon, hal tersebut menyebabkan dia berfungsi sebagai antioksidan karena mampu mencegah zat komposisi yang lain teroksidasi. Setelah vitamin C mendonorkan elektronnya, dia akan menghilang dan digantikan oleh radikal bebas semidehydroaskorbic acid atau radikal ascorbyl, bila dibandingkan dengan radikal bebas yang lain, radikal ascorbyl ini relatif stabil dan tidak reaktif (Padayatty et al., 2003). Bila radikal ascorbyl dan dehydroascorbic acid sudah dibentuk maka dia akan dapat direduksi kembali menjadi asam askorbat sedikitnya dengan tiga jalur enzim yang terpisah dengan cara mereduksi komponen yang terdapat di sistem biologi seperti glutation, akan tetapi pada manusia hanya sebagian yang direduksi kembali menjadi asam askorbat. Dehydroascorbic acid yang telah terbentuk kemudian dimetabolisme dengan cara hidrolisis (Padayatty et al., 2003) Efek Kimia Vitamin C Asam askorbat berfungsi sebagai anti oksidan, anti aterogenik, imunomodulator dan mencegah flu (Naidu, 2003). Untuk dapat berfungsi baik sebagai antioksidan, kadar asam askorbat harus terjaga tetap dalam kadar yang relatif

31 tinggi di dalam tubuh (Gupta et al., 2007). Pemberian suplemen vitamin C, vitamin E dan quercetin pada tikus yang diberi MSG dengan dosis 4 mg/g berat badan dapat menurunkan kadar MDA yang muncul akibat MSG. Vitamin E menurunkan kadar lipid peroksidasi di hati diikuti oleh vitamin C dan kemudian quercetin, sementara vitamin C dan quercetin menunjukkan kemampuan lebih besar dalam melindungi otak dari kerusakan dibandingkan dengan vitamin E (Farombi dan Onyema, 2006) Efek Vitamin C terhadap Fungsi Reproduksi Asam askorbat memberikan efek baik kepada integitas dari struktur tubular maupun terhadap fungsi sperma. Defisiensi asam askorbat telah lama dihubungkan dengan jumlah sperma yang rendah, peningkatan jumlah sperma yang abnormal, mengurangi motilitas dan aglutinasi. Pada beberapa penelitian telah dibuktikan bahwa asupan asam askorbat dapat memperbaiki kualitas sperma. Efek yang menguntungkan dari asam askorbat ini mungkin adalah hasil dari pemecahan radikal bebas yang sering timbul akibat polusi lingkungan dan metabolisme selular yang dapat menyebabkan kerusakan oksidatif dari DNA (Agarwal et al., 2005). Stres oksidatif dapat dibatasi dengan menggunakan antioksidan berupa suplemen vitamin E dan C. Vitamin C dapat menetralisir radikal hidroksil, superoksid, dan hidrogen peroksida dan mencegah aglutinasi sperma. Vitamin C sedikit jumlahnya pada cairan semen laki-laki infertil. Vitamin C dapat meningkatkan jumlah sperma in vivo pada laki-laki infertil dengan dosis oral sekitar mg/hari (Agarwal et al., 2005).

32 Begitu juga, kelinci usia 5 bulan yang diberi suplemen vitamin C 1,5 g/l dan vitamin E 1 g/l pada minumannya dan kombinasi vitamin C + vitamin E (1,5 g/l+1 g/l) selama 12 minggu memperlihatkan penurunan kadar thiobarbituric acid-reactive di dalam cairan semen serta peningkatan libido (waktu reaksi), volume ejakulasi, konsentrasi sperma, jumlah sperma yang dikeluarkan, indeks motilitas sperma, total sperma yang bergerak, volume sperma, konsentrasi ion hidrogen (ph), dan konsentrasi fruktosa semen serta penurunan jumlah sperma bentuk abnormal dan sperma yang mati dan peningkatan kadar glutathione S-transferase (GST) di dalam cairan semen. Hal ini menyimpulkan bahwa pemberian suplemen vitamin C, vitamin E dan kombinasi keduanya menurunkan produksi radikal bebas dan dapat memperbaiki kualitas cairan semen tapi perbaikan lebih besar kelihatan berasal dari vitamin E (Yousef et al., 2003) Fisiologi Reproduksi Mencit Jantan Sistem reproduksi mencit jantan terdiri atas testis dan kantong skrotum, epididimis dan vas deferens, sisa sistem ekskretori pada masa embrio yang berfungsi untuk transport sperma, kelenjar asesoris, uretra dan penis. Selain uretra dan penis, semua struktur ini berpasangan (Rugh, 1967) Testis Setiap testis ditutupi dengan jaringan ikat fibrosa, tunika albuginea, bagian tipisnya atau septa akan memasuki organ untuk membelah menjadi lobus yang mengandung beberapa tubulus disebut tubulus seminiferus. Bagian tunika memasuki

33 testis dan bagian arteri testicular yang masuk disebut sebagai hilus. Arteri memberi nutrisi setiap bagian testis, dan kemudian akan kontak dengan vena testiskular yang meninggalkan hilus (Rugh, 1967). Epitel tubulus seminiferus berada tepat di bawah membran basalis yang dikelilingi oleh jaringan ikat fibrosa yang tipis. Antara tubulus adalah stroma interstisial, terdiri atas gumpalan sel leydig ataupun sel sertoli dan kaya akan darah dan cairan limfe. Sel interstisial testis mempunyai inti bulat yang besar dan mengandung granul yang kasar. Sitoplasmanya bersifat eosinofilik. Diyakini bahwa jaringan interstisial menguraikan hormon jantan testosterone. Epitel seminiferus tidak mengandung sel spermatogenik secara eksklusif, tetapi mempunyai nutrisi yang menjaga sel sertoli, yang tidak dijumpai di tubuh lain. Sel sertoli bersentuhan dengan dasarnya ke membran basalis dan menuju lumen tubulus seminiferus. Di dalam inti sel sertoli terdapat nukleolus yang banyak, satu bagian terdiri atas badan yang bersifat asidofilik di sentral dan sisanya badan yang bersifat basidofilik di perifer. Sel sertoli diperkirakan mempunyai banyak bentuk tergantung aktivitasnya. Pada masa istirahat berhubungan dekat dengan membran basalis di dekatnya dan inti ovalnya paralel dengan membran. Sel sertoli sebagai sel penyokong untuk metamorfosis spermatid menjadi spermatozoa dan retensi sementara dari spermatozoa matang, panjang, piramid dan intinya berada tegak lurus dengan membran basalis. Sitoplasma dekat lumen secara umum mengandung banyak kepala spermatozoa yang matang sedangkan ekornya berada bebas dalam lumen (Rugh, 1967).

34 Spermatogenesis Sel germinal primordial mencit jantan muncul sekitar 8 hari kehamilan, dengan jumlah hanya 100, yang merupakan awal dari jutaan spermatozoa yang akan diproduksi dan masih berada di daerah ekstra gonad. Karena sel germinal kaya akan alkalin fosfatase untuk mensuplai energi pergerakannya melalui jaringan embrio, maka sel germinal dapat dikenal dengan teknik pewarnaan. Pada hari ke 9 dan 10 kehamilan sebagian mengalami degenerasi dan sebagian lain mengalami proliferasi dan bahkan bergerak (pada hari ke 11 dan 12) ke daerah genitalia. Pada saat itu jumlahnya mencapai sekitar 5000 dan identifikasi testis dapat dilakukan. Proses proliferasi dan differensiasi berlangsung di daerah medulla testis. Pada kasus steril, kehilangan sel germinal berlangsung selama perjalanan dari bagian ekstra gonad menuju daerah genitalia. Menuju akhir masa fetus, aktivitas mitosis sel germinal primordial dalam bagian genitalia berkurang dan beberapa sel mulai degenerasi menjelang hari ke-19 kehamilan. Tidak berapa lama setelah kelahiran, sel tampak lebih besar, yaitu spermatogonia. Setelah itu akan ada spermatogonia dalam testis mencit sepanjang hidupnya. Ada 3 jenis spermatogonia: tipe A, tipe intermediate dan tipe B (Rugh, 1967). Tipe A adalah induk stem cell yang mampu mengalami mitosis sampai menjadi spermatozoa. Spermatogonia tipe A yang paling besar dan mengandung inti kromatin yang mirip partikel debu halus dan nukleolus kromatin tunggal terletak eksentrik. Kromosom metafasenya panjang dan tipis. Dapat meningkat, melalui spermatogonia intermediate menjadi spermatogonia B yang lebih kecil, lebih banyak,

35 dan mengandung inti kromatin serpihan kasar di atas atau dekat permukaan dalam membran inti. Terdapat plasmosom mirip nukleolus yang terletak di tengah. Kromosom metafase biasanya pendek, bulat, dan mirip kacang. Spermatogonia tipe B membelah dua untuk meningkatkan jumlahnya atau berubah menjadi spermatosit primer, lebih jauh dari membran dasar. Diperkirakan lamanya dari metafase spermatogonia menjadi profase meiosis sekitar 3 sampai 9 hari, menuju metafase kedua selama 4 hari atau kurang, dan menuju spermatozoa imatur selama 7 hari atau lebih. Maka, waktu dari metafase spermatogonia menjadi spermatozoa imatur paling sedikit 10 hari (Rugh, 1967). Sel tipe A pertama kali muncul 3 hari setelah kelahiran. Ketika jumlahnya meningkat, sel germinal primordial yang merupakan asalnya dan kemudian berada di samping membran dasar, akan berkurang jumlahnya. Pembelahan meiosis dalam testis mulai 8 hari setelah kelahiran. Tanda pertama bahwa spermatogonia B akan metamorfosis menjadi spermatosit primer adalah pembesaran dan bergerak menjauhi membran dasar. Spermatosit primer membelah menjadi 2 spermatosit sekunder yang lebih kecil, yang kemudian membelah menjadi 4 spermatid. Mereka mengalami metamorfosis radikal menjadi spermatozoa matur dengan jumlah yang sama, kehilangan sitoplasmanya dan berubah bentuk (Rugh, 1967). Antara tahap spermatosit primer dan sekunder, materi kromatin harus membelah. Sintesa premeiotik DNA terjadi di spermatosit primer selama fase istirahat dan berakhir sebelum onset profase meiosis, rata-rata selama 14 jam. Tidak ada pembentukan DNA terjadi pada tahap akhir spermatogenesis. Proses

36 spermatogenesis mencit pada dasarnya sama dengan mamalia lain. Satu siklus epitel seminiferus selama 207±6 jam, dan 4 siklus yang mirip terjadi antara spermatogonia A dan spermatozoa matur. Produksi spermatozoa matur dari sel spermatogonia berlangsung 5 minggu pada mencit. Testis dan khususnya spermatozoa matur, merupakan sumber hyaluronidase terkaya, dan enzim ini efektif membubarkan sel cumulus sekitar ovum matur pada saat fertilisasi. Setiap spermatozoa membawa enzim yang cukup untuk membersihkan jalan melalui sel cumulus menuju matriks jel ovum. Bahan asam hialuronik semen cenderung bergabung ke sel granulosa sel cumulus, agar kepala sperma dapat disuplai dengan enzim melimpah (Rugh, 1967).

37 BAB III METODE PENELITIAN 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian telah dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Universitas Sumatera Utara dimulai dari tanggal 30 Mei sampai dengan 22 Juli Variabel Penelitian Variabel Independen a. Monosodium Glutamate (MSG). b. Vitamin C Variabel Dependen a. Jumlah sperma. b. Morfologi sperma Definisi Operasional a. Jumlah sperma adalah banyaknya sperma yang diperoleh dari cauda epididimis dalam sperma/ml suspensi. b. Morfologi sperma normal dan abnormal yang diperoleh dari cauda epididimis. 1) Morfologi sperma normal yaitu mempunyai bentuk kepala seperti kait pancing dan ekor panjang lurus.

38 2) Morfologi sperma abnormal mempunyai bentuk kepala tidak beraturan, dapat berbentuk seperti pisang, atau tidak beraturan (amorphous), atau terlalu bengkok, dan ekornya tidak lurus bahkan tidak berekor, atau hanya terdapat ekornya saja tanpa kepala (Washington et al., 1983) Bahan dan Alat Penelitian Bahan Penelitian Bahan biologis. Bahan biologis yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan (Mus musculus L.) strain DD Webster dewasa fertil berumur ± 3 bulan dengan berat badan gram yang diperoleh dari Unit Pra Klinik LPPT Universitas Gajah Mada (UGM) Yogyakarta. Jumlah hewan uji perkelompok ditentukan dengan rumus (t-1) (n-1) 15. Jika t adalah jumlah perlakuan (dalam penelitian ini ada 5 kelompok perlakuan) dan n adalah jumlah ulangan perkelompok, maka jumlah n yang diharapkan (teoritis) adalah 5 (Federer, 1963). Sehingga jumlah keseluruhan hewan coba yang diperlukan dalam penelitian ini adalah sebanyak 25 ekor yang dipilih dari hasil perbanyakan untuk keperluan penelitian. Persetujuan ethical clearance dari Komisi Etika Penelitian Kesehatan Wilayah Sumatera Utara Medan. Bahan kimia. Bahan kimia yang dibutuhkan untuk meneliti efek pemberian vitamin C terhadap jumlah sperma dan morfologi sperma mencit jantan dewasa yang dipaparkan MSG adalah Monosodium glutamate murni, Vitamin C, NaCl 0,9%, Giemsa, Eosin-Y, Alkohol 70% (Merck) dan Aquadest.

39 Peralatan Utama Penelitian Alat utama yang digunakan dalam penelitian antara lain: jarum oval (Gavage), bak bedah dan dissecting set, gelas arloji, cawan petri, batang pengaduk, timbangan (balance) dengan ketelitian 0,01 gram, objek glas, cover glass, spuit insulin 1 ml, kamar hitung Improved Neubauer dan mikroskop cahaya Disain Penelitian Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental yang didisain mengikuti Rancangan Acak Lengkap (RAL). Penelitian ini terdiri atas 5 kelompok perlakuan, yaitu: a) Kelompok I (P0) = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi larutan NaCl 0,9% sebanyak 0,5 ml secara intraperitoneal selama 30 hari. b) Kelompok II (P1) = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi MSG 4 mg/g berat badan yang dilarutkan dalam 0,5 ml larutan NaCl 0,9% secara intraperitoneal setiap hari selama 15 hari selanjutnya 15 hari berikutnya diberikan larutan NaCl 0,9% sebanyak 0,5 ml secara intraperitoneal setiap hari. c) Kelompok III (P2) = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi MSG 4 mg/g berat badan yang dilarutkan dalam 0,5 ml larutan NaCl 0,9% secara intraperitoneal setiap hari selama 30 hari. d) Kelompok IV (P3) = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi MSG 4 mg/g berat badan yang dilarutkan dalam 0,5 ml larutan NaCl 0,9%

40 secara intraperitoneal setiap hari selama 15 hari pertama, selanjutnya 15 hari berikutnya diberikan vitamin C 0,2 mg/g berat badan yang dilarutkan dalam 0,5 ml aquadest secara oral setiap hari. e) Kelompok V (P4) = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi MSG 4 mg/g berat badan yang dilarutkan dalam 0,5 ml larutan NaCl 0,9% secara intraperitoneal setiap hari selama 15 hari pertama, selanjutnya 15 hari berikutnya pemberian MSG diteruskan disertai dengan pemberian vitamin C 0,2 mg/g berat badan yang dilarutkan dalam 0,5 ml aquadest secara oral setiap hari. Mencit ditempatkan ke dalam kelompok secara random. P4 P3 P2 MSG MSG MSG MSG + Vitamin C Vitamin C MSG P1 MSG Larutan NaCl 0,9% P0 Larutan NaCl 0,9 % Larutan NaCl 0,9 % (hari)

41 3.6. Pelaksanaan Penelitian Pemeliharaan Hewan Percobaan Mencit ditempatkan di dalam kandang yang terbuat dari bahan plastik (ukuran 30x20x10 cm) yang ditutup dengan kawat kasa. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5-1 cm dan diganti setiap tiga hari. Cahaya ruangan dikontrol persis 12 jam terang (pukul sampai dengan pukul 18.00) dan 12 jam gelap (pukul sampai dengan pukul 06.00), sedangkan suhu dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Pakan (pelet komersial) dan minum (air PAM) disuplai setiap hari secara berlebih. Persetujuan ethical clearance dari Komisi Etika Penelitian Kesehatan Wilayah Sumatera Utara Medan Pengamatan Setelah 30 hari perlakuan, masing-masing hewan coba dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dibedah. Selanjutnya dilakukan pengamatan sebagai berikut: Pengambilan sekresi cauda epididimis Untuk mendapatkan sperma di dalam sekresi cauda epididimis dilakukan menurut Soehadi dan Arsyad (1983) sebagai berikut: Setelah 30 hari perlakuan, masing-masing hewan percobaan dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dibedah. Kemudian organ testis beserta epididimis sebelah kanan diambil dan diletakkan ke dalam cawan petri yang berisi NaCl 0,9%. Di bawah mikroskop bedah dengan pembesaran 400 kali cauda epididimis dipisahkan dengan cara memotong bagian proximal corpus epididimis dan bagian distal vas deferens. Selanjutnya cauda

42 epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi 1 ml NaCl 0,9%, kemudian bagian proximal cauda dipotong sedikit dengan gunting lalu cauda ditekan dengan perlahan hingga sekresi cairan epididimis keluar dan tersuspensi dengan NaCl 0,9%. Suspensi sperma dari cauda epididimis yang telah diperoleh dapat digunakan untuk pengamatan yang meliputi: jumlah sperma, dan morfologi sperma Pengamatan sperma Pengamatan sperma dilakukan sebagai berikut: Suspensi sperma yang telah diperoleh terlebih dahulu dihomogenkan. Selanjutnya diambil sebanyak 10 µl sampel dan dimasukkan ke dalam kotak-kotak hemositometer Improved Neubauer serta ditutup dengan kaca penutup. Di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali, hemositometer diletakkan dan dihitung jumlah sperma pada kotak/bidang A,B,C,D, dan E. Hasil perhitungan jumlah sperma kemudian dimasukkan ke dalam rumus penentuan jumlah sperma/ml suspensi sekresi cauda epididimis sebagai berikut: Jumlah sperma = N / 2 x 10 5 suspensi sperma/ml dimana N = jumlah sperma yang dihitung pada kotak A,B,C,D,dan E.

43 Gambar 3.1. Kamar Hitung Improved Neubauer (Zaneveld et al., 1986) Morfologi sperma Untuk menentukan morfologi sperma, diambil sperma dari cauda epididimis tersebut di atas dan dibuat sediaan hapus pada kaca objek, dikeringkan. Kemudian diberi alkohol 70% selama 15 menit, dikeringkan dan diberi perwarnaan Giemsa selama 15 menit. Setelah itu dibilas dengan air kran dan dikeringkan. Kemudian dengan mikroskop cahaya dihitung dengan jumlah 100 sperma, ditentukan persentasi sperma yang normal dan abnormal. Untuk mendapatkan hasil akhirnya, jumlah persentase sperma yang normal kiri dan kanan cauda epididimis dijumlah kemudian diambil rata-ratanya. Ciri sperma normal yaitu mempunyai bentuk kepala seperti kait pancing dan ekor panjang lurus, sedangkan sperma abnormal mempunyai bentuk

44 kepala tidak beraturan, dapat berbentuk seperti pisang, atau tidak beraturan (amorphous), atau terlalu bengkok, dan ekornya tidak lurus bahkan tidak berekor, atau hanya terdapat ekornya saja tanpa kepala (Gambar 3.2). A B C D Gambar 3.2. Morfologi Sperma Vas Deferen Mencit (Washington et al., 1983) Gambar A adalah Sperma Normal, dengan Kepala Seperti Kait Pancing, Gambar B, C dan D adalah Sperma Abnormal (B = Sperma dengan Kepala Seperti Pisang, C = Sperma Tidak Beraturan, dan D = Sperma Terlalu Bengkok) 3.7. Analisa Data dan Pengujian Hipotesis Semua data dipresentasikan dalam bentuk rata-rata ± simpangan baku (ratarata ± SD). Dilakukan uji normalitas dan homogenitas data. Jika data berdistribusi normal dan homogen maka dilakukan uji ANOVA. Bila terdapat perbedaan nyata

45 dilanjutkan dengan uji Post Hoc analisis Benferroni taraf 5% untuk melihat perbedaan antar kelompok kontrol dan masing-masing perlakuan. Jika distribusi data tidak normal dan atau tidak homogen, maka dilakukan transformasi data. Kemudian diuji lagi normalitas dan homogenitas data. Apabila masih tidak normal distribusinya dan data tidak homogen maka diuji dengan uji Mann Whitney untuk membandingkan antara 2 kelompok perlakuan (kontrol vs perlakuan). Pada kelompok data lebih dari 2 kelompok maka dilakukan uji Friedman. Semua analisa data dilakukan dengan menggunakan SPSS versi 15,0. Dalam penelitian ini, hanya perbedaan rata-rata pada á 0,05 yang dianggap bermakna (signifikan) Jadwal Penelitian Keseluruhan kegiatan penelitian dari persiapan sampai pada penulisan hasil penelitian adalah lebih kurang tujuh minggu. Urutan kegiatan dan jadwal pelaksanaan secara lengkap dapat dilihat pada tabel berikut ini. Tabel 3.1. Jadwal Penelitian No Kegiatan Minggu Ke PERSIAPAN 2 PELAKSANAAN 3 ANALISA DATA 4 PENULISAN HASIL

46 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Penelitian Berat Badan Awal dan Akhir Mencit Jantan Dewasa Dari penelitian ini diperoleh hasil pengukuran berat badan awal dan berat badan akhir mencit jantan dewasa (Mus musculus, L) strain DD Webster adalah sebagai berikut: Tabel 4.1. Pengamatan Berat Badan Awal dan Akhir Mencit Jantan Dewasa Kelompok n Berat Badan Mencit ( g ) Awal Akhir P value P ± ± P ± ± P ± ± P ± ± P ± ± Nilai adalah rata-rata ± SD Berdasarkan Tabel 4.1 di atas hasil uji statistik berat badan awal dan berat badan akhir subjek terjadi perubahan tidak bermakna baik yang diberi MSG dan Vitamin C secara tersendiri maupun bersamaan pada perlakuan.