METODE Desain, Waktu dan Tempat Bahan dan Alat Tahapan penelitian

Transkripsi

1 15 METODE Desain, Waktu dan Tempat Penelitian ini bersifat eksperimental yang dilaksanakan pada Mei- November Tempat yang digunakan ialah Laboratorium Analisis Kimia dan Makanan, Departemen Gizi Masyarakat - FEMA IPB; Laboratorium Kimia, Departemen Kimia - FMIPA IPB; Laboratorium Balai Besar Industri Agro, Cikaret Bogor; Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, LPPM IPB, Laboratorium Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik, Cimanggu Bogor; dan Laboratorium Keamanan Pangan PT. Saraswanti Indo Genetech di Gedung Alumni IPB. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya daun murbei segar, akuades, etanol 96%, HCl 4 N, Cu 2+ dalam bentuk Cu-asetat, NaOH 4 N, maltodekstrin, asam nitrat pekat, asam nitrat 1 N, H 2 O 2 pekat, H 2 SO 4 pekat, larva udang laut, air laut, methanol pa, vitamin C, air bebas ion, larutan DPPH, standar etanol, standar internal n-propanol dan akuabides. Peralatan yang digunakan diantaranya timbangan, timbangan analitik, blender, gunting, wadah-wadah plastik, kain saring halus (60 mesh), corong Buchner, pompa vakum, kertas saring Whatman no. 40 dan no. 42, ph meter, gelas piala berbagai ukuran, gelas takar, magnetic stirrer, homogenizer, aluminium foil, freezer, refrigerator, spray dryer, kantong plastik bening, The Royal Horticultural Society s Colour Chart, labu takar 100 ml, labu takar 50 ml, penangas air, sentrifuse, tabung sentrifuse, corong penyaring, pipet volumetrik, labu Erlenmeyer 100 ml, Erlenmeyer 250 ml, AAS (Atomic Absorption Spectrophotometer) Shimadzu AA-7000, lampu Hollow Cathode untuk Cu, vial, pipet mikro, aerator, vortex, pipet tetes, shaker, tabung reaksi, spektrofotometer UV-Vis, kuvet, tabung tertutup, labu lemak, rotaporator, oven, botol semprot, desikator, cawan aluminium, sudip, pipet mikro, dan kromatografi gas Clarus 500. Tahapan penelitian Adapun tahapan penelitian diantaranya pembuatan, analisis karakteristik fisiko-kimia dan uji toksisitas bubuk Cu-turunan klorofil, serta analisis aktivitas antioksidan dan analisis kadar alkohol bubuk Cu-turunan klorofil terpilih.

2 16 Pembuatan bubuk Cu-turunan klorofil dari daun murbei Ekstraksi dan penyiapan Cu-turunan klorofil dilakukan mengacu pada penelitian Nurdin et al. (2009) yang menggunakan Metode Tanucci dan von Elbe (1992) yang dimodifikasi. Daun murbei yang digunakan adalah daun murbei varietas Kanva yang diambil dari Teaching Farm Sutera Alam (TFSA) IPB di Desa Sukamantri. Bagian daun murbei yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun yang matang fisiologis dan merupakan produk samping dari budidaya ulat sutera. Helai daun yang dipilih adalah helai daun keenam ke bawah dihitung dari puncak dan dipanen sebelum matahari terbit. Kemudian daun murbei dicuci di bawah air mengalir, lalu dilap dan dikering-anginkan. Ketika akan digunakan daun dipotong 1-2 cm dengan gunting untuk memudahkan proses penghancuran. Proses ekstraksi klorofil dilakukan di dalam ruangan gelap. Sebanyak ± 200 gram potongan daun dihancurkan dengan blender menggunakan 800 ml etanol 96% selama 3 menit, secara terputus setiap 1 menit. Hancuran daun kemudian disaring dengan kain saring halus (60 mesh). Ekstraksi dilakukan berulang sampai didapatkan warna ampas yang putih. Lalu filtrat yang diperoleh disaring lagi dengan corong Buchner yang dibantu pompa vakum menggunakan kertas saring Whatman no. 40. Residu dicuci dengan 200 ml etanol 96% kemudian disaring lagi dengan corong Buchner. Filtrat diambil sebagai ekstrak kasar klorofil. Pembentukan turunan klorofil (pheophytin) dilakukan dengan cara mengasamkan ekstrak klorofil dengan menambahkan HCl 4 N hingga mencapai ekstrak berwarna coklat zaitun yang merupakan indikator Mg lepas dari klorofil (Marquez 2005). Penurunan ph dilakukan secara bertahap, dan tetap diaduk selama pereaksian, selanjutnya ditambahkan Cu. Penentuan jumlah Cu yang ditambahkan mengacu pada penelitian Kandiana (2010) yang mengasumsikan bahwa mol Cu mol Cu-pheophytin mol pheophytin dan reaksi berlangsung sempurna dengan persamaan reaksi sebagai berikut. Klorofil + HCl turunan klorofil (pheophytin) pheophytin + Cu Cu- pheophytin Penentuan mol Cu dalam penelitian ini sebagai berikut. Berat klorofil/liter = % total padatan klorofil x 1000 = 0,75615/100 x 1000 = 7,5615 g

3 17 Berat pheophytin = BM pheophytin /BM klorofil x berat klorofil = 871,21/893,5 x7,5615 g = 7,3729 mol pheophytin = Berat pheophytin /BM pheophytin = 7,3729/871,21 = 0,008 mol Berdasarkan hasil perhitungan diperoleh 0,008 mol sebagai batas atas taraf jumlah Cu yang ditambahkan, sehingga taraf penambahan Cu adalah 0 mol; 0,001 mol; 0,002 mol; 0,004 mol; 0,006 mol dan 0,008 mol. Cu yang ditambahkan dalam bentuk Cu-asetat [(CH 3 COO) 2 Cu.H 2 O] sebesar 0 mg; 199,64 mg; 399,28 mg; 799,56 mg; 1197,84 mg dan 1596,8 mg setiap 1 liter larutan. Cu-asetat yang telah ditentukan jumlahnya sesuai perlakuan terlebih dahulu dilarutkan dalam 10 ml akuades. Ekstrak turunan klorofil yang telah ditambahkan Cu 2+ dinaikkan ph-nya mencapai 8,5 dengan menambahkan NaOH 4 N. Reaksi dilakukan di dalam tempat tertutup selama 24 jam pada suhu ruang dan terlindung dari cahaya serta diaduk menggunakan magnetic stirrer. Setelah reaksi berlangsung sempurna, ditandai dengan terbentuknya warna hijau cerah. Campuran tersebut ditambahkan maltodekstrin 3% (Alsuhendra 2004). Reaksi dilakukan selama 30 menit menggunakan homogenizer. Kecepatan homogenizer diatur pada skala F. Setelah reaksi selesai, campuran dimasukkan ke dalam freezer (-20 0 C) dan didiamkan selama semalam sebelum dikeringkan dengan pengering semprot (spray dryer). Setelah campuran kering, maka diperoleh bubuk Cu-turunan klorofil.

4 18 Daun murbei segar (200 g) - Diekstrak (etanol 96%) - Disaring Filtrat Disaring (Buchner) - Diekstrak (etanol 96%) - Disaring Ampas Filtrat Ampas Ekstrak Klorofil Maltodextrin 3% Bubuk Klorofil HCl 4 N Spray dryer Ekstrak Turunan Klorofil Cu-asetat 0 mol 0,001 mol 0,002 mol 0,004 mol 0,006 mol 0,008 mol NaOH 4 N Cu-Turunan Klorofil - Ditambah maltodextrin 3% - Pengadukan (magnetic stirrer) - Homogenizer - Spray dryer (suhu inlet 78 0 C, outlet C) Bubuk Cu-Turunan Klorofil Gambar 2. Diagram alir pembuatan bubuk Cu-turunan klorofil daun murbei

5 19 Analisis karakteristik fisiko-kimia bubuk Cu-turunan klorofil Analisis karakteristik fisik yang dilakukan diantaranya rendemen (AOAC 1995 yang dimodifikasi), kelarutan (Fardiaz et al. 1992) dan warna (RHS 2001). Prosedur disajikan pada Lampiran 1. Analisis karakteristik kimia yang dilakukan diantaranya kadar air (Apriyantono et al. 1989) dan ph (Apriyantono et al. 1989), prosedur disajikan dalam Lampiran 2, serta kadar Cu total dan Cu-Chlorophyllin (USPC 2006 yang dimodifikasi). a. Analisa kadar Cu bebas Untuk membuat larutan uji, timbang 500 mg yang dimasukkan ke dalam gelas piala lalu ditambahkan akuades 75 ml. Aduk hingga seluruh bubuk terlarut dengan cara menggoyangkan gelas piala. Tambahkan asam nitrat 1 N sampai ph 3, suspensi dipindahkan ke dalam labu takar 100 ml dan ditambah akuades sampai 100 ml lalu dikocok. Suspensi tersebut di sentrifuse dan disaring dengan kertas saring Whatman no. 42. Filtrat diambil sebanyak 5 ml menggunakan pipet volumetrik ke dalam labu Erlenmeyer 100 ml kemudian ditambahkan 2 ml asam nitrat pekat dan didiamkan semalam. Kemudian filtrat dipanaskan secara hati-hati sampai asam nitrat menguap seluruhnya yang ditandai dengan warna uap berwarna putih. Selanjutnya filtrat diencerkan dengan akuades sampai 50 ml di dalam labu takar. Larutan yang telah diencerkan kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatman no.42 ke dalam tabung reaksi tertutup. Selanjutnya larutan ditentukan konsentrasinya dengan menggunakan alat AAS (Atomic Aborption Spectrophotometer) Shimadzu AA-7000 pada 327,4 nm dengan flame: udara-acetilene, lampu Hollow cathode nomor 1, arus 8 ma, slit 0,02 mm dan Mode: BGC-D2. b. Analisa kadar Cu total Untuk membuat larutan uji, timbang 100 mg sampel yang dimasukkan ke labu Erlenmeyer, ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat, 1 ml asam nitrat pekat, 1 ml hidrogen peroksida pekat dan didiamkan semalam. Sampel kemudian dipanaskan sampai berwarna hijau jernih. (Catatan: Jika larutan berwarna coklat ditambah asam nitrat 0,5 ml sampai warna hijau). Larutan didinginkan lalu dipindah ke labu takar 50 ml, encerkan dengan akuades sampai 50 ml, lalu dikocok. Larutan yang telah diencerkan kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatman no.42 ke dalam tabung reaksi tertutup. Kemudian larutan diukur konsentrasingan dengan menggunakan alat AAS (Atomic Absorption Spectrophotometer) Shimadzu AA-7000 pada 327,4 nm

6 20 dengan flame: udara-acetilene, lampu Hollow cathode nomor 1, arus 8 ma, slit 0,02 mm dan Mode: BGC-D A b s o r b a n s i y = x R² = Konsentrasi Cu standar (ppm) Gambar 3 Kurva Cu standar Cara perhitungan kadar Cu bebas (ppm) dan Cu total (ppm) = (Abs. Sampel-Abs Blanko) x aliquot b a Berat Sampel Keterangan: Nilai a dan b diperoleh dari persamaan garis y = 0,060x + 0,028 (kurva Cu standar) c. Analisa kadar Cu yang terikat Cu terikat (ppm) = Cu total (ppm) Cu bebas (ppm) = A (ppm) Cu terikat (mol) = A x 10-6 g Berat Atom Cu d. Menghitung kadar Cu-Chlorophyllin mol Cu terikat mol Cu-Chlorophyllin Cu-Chlorophyllin (mg/g) = Cu terikat (mol) x Berat Molekul Cu-Chlorophyllin Keterangan: BA Cu = 63,55; BM Cu-Chlorophyllin = 724,15

7 21 Uji toksisitas metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) Uji toksisitas metode BSLT mengacu pada metode Meyer et al. (1982). Telur udang ditetaskan dalam gelas piala berukuran 2 liter yang sudah berisi air laut dan dilengkapi aerator. Telur udang akan menetas menjadi larva udang dalam waktu 2 x 24 jam. Selanjutnya membuat larutan sampel stok, misalkan 2000 ppm. Setiap vial diisi 1 ml air laut yang berisi 10 ekor larva udang. Vial tersebut ditambahkan larutan sampel stok dan air laut yang mencapai 2 ml larutan sehingga konsentrasi larutan menjadi 10 ppm, 100 ppm, 500 ppm, 1000 ppm kemudian dibiarkan selama 24 jam. Jumlah larva udang yang mati dicatat dan data yang diperoleh diolah menggunakan probit analysis untuk mengetahui Lethal Concentration (LC 50 ) dengan tingkat kepercayaan 95%. LC 50 adalah konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian larva udang kira-kira 50%. Meyer et al. (1982) menyebutkan bahwa tingkat toksisitas suatu ekstrak mengikuti pedoman sebagai berikut: LC ppm = sangat toksik 30 < LC ppm = toksik LC 50 > 1000 ppm = tidak toksik Analisis Aktivitas Antioksidan dan Kadar Alkohol Bubuk Cu-turunan klorofil terpilih a. Analisis aktivitas antioksidan metode DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl) Analisis aktivitas antioksidan ini mengacu pada metode Blois (1958) yang dimodifikasi. Sampel diambil sebanyak 2,5 gram dilarutkan dalam 25 ml methanol pa (murni). Campuran kemudian diaduk dengan menggunakan shaker selama 2 jam. Selanjutnya dipisahkan filtrat dan residu sampel menggunakan alat sentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm selama 15 menit. Lakukan pemisahan filtrat dengan residu secara berulang sampai warna filtrat bening. Filtrat kemudian dipekatkan dengan alat rotaporator. Hasil dari pemekatan filtrat selanjutnya ditambahkan methanol pa hingga mencapai volume 5 ml. Filtrat yang telah melalui prosedur di atas kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 20 μl lalu ditambahkan larutan DPPH (1 mm sebanyak 1 ml dan ditambahkan air bebas ion sampai volume mencapai 5 ml. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C atau suhu ruang selama 30 menit. Reaksi dilakukan di ruangan redup (gelap), selanjutnya serapannya diukur pada panjang gelombang 516 nm. Sebagai kontrol positif dan untuk

8 22 pembanding digunakan vitamin C (konsentrasi 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000 ppm). Satuan aktivitas antioksidan dinyatakan dalam AEAC (Ascorbatic acid Equivalent Antioxidant Capacity) A b s o r b a n s i y = x R² = Konsentrasi Vitamin C standar (ppm) Gambar 4 Kurva standar Vitamin C setelah direaksikan dengan DPPH Cara perhitungan aktivitas antioksidan Aktivitas antioksidan atau AAO (%) = (Abs. blanko Abs. sampel ) x 100% Abs. blanko Ascorbic acid Equivalent Antioxidant Capacity (AEAC) (% AAO - b) Volume akhir AEAC (mg/ 100 g) = [ x a Vol.yang ditambahkan ]x 100 Berat sampel Keterangan: Nilai a dan b diperoleh dari persamaan garis y = 4,224x + 1,892 b. Analisis Kadar Alkohol menggunakan Kromatografi Gas Metode analisis kadar alkohol ini mengacu pada metode USPC 2006, yang dimodifikasi. Kondisi alat kromatografi gas yang digunakan diantaranya menggunakan detektor flame-ionization serta memiliki suhu injektor C, suhu detektor C, suhu kolom awal C, suhu akhir C dan dipertahankan selama 5-10 menit. Gas helium digunakan sebagai gas pembawa tekanan 0.5 kg/cm 2.

9 23 Persiapan sampel dan larutan standar Timbang 1-2 g sampel dimasukkan ke dalam labu lemak kemudian ditambahkan 150 ml akuades. Lakukan destilasi hingga hasil destilasi mencapai volume ml yang ditampung dengan labu ukur 100 ml. Larutan sampel yang telah didestilasi diambil 5 ml menggunakan pipet mikro dan dimasukkan ke dalam labu takar 50 ml, kemudian ditambahkan 5 ml n- propanol dan ditera dengan akuabides. Larutan standar dibuat dengan cara menambahkan 5 ml etanol dan 5 ml n-propanol ke dalam labu takar 50 ml dan ditera dengan akuabides Penentuan kadar etanol (%) sampel Larutan sampel diambil 5 µl dan disuntikan ke dalam kolom melalui tempat injeksi kromatografi gas sampai diperoleh hasil kromatogram. Lakukan hal yang sama pada larutan standar. Hitung luas area larutan standar dan sampel dengan cara: Luas area = respon atau tinggi peak (µv) x waktu (detik) konsentrasi etanol Kadar alkohol (%) = faktor pengenceran sampel luas area sampel x luas area standar Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan satu faktor perlakuan yaitu penambahan Cu-asetat. Peubah respon yang diamati adalah rendemen, kelarutan, kadar air, ph, kadar Cu total, kandungan Cu-chlorophyllin; serta toksisitas yang dinyatakan dengan nilai LC 50. Secara sistematis, bentuk umum dari rancangan tersebut adalah sebagai berikut: Y ij = μ + A i + ε ij Y ij : peubah respon akibat perlakuan ke-i dengan ulangan ke-j μ. : nilai rata-rata umum A i : pengaruh penambahan Cu-asetat pada taraf ke-i ε ij : galat unit percobaan akibat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j i : banyak taraf tingkat penambahan Cu-asetat (i=0; 0,001; 0,002; 0,004; 0,006; 0,008) mol j : banyak ulangan (j=1, 2)

10 24 Pengolahan dan Analisis Data Data hasil penelitian diolah dengan menggunakan Microsof Excell for Windows, kemudian dianalisis menggunakan program SPSS System for Windows v Data hasil analisis diuji secara statistik dengan Analysis of Variance (ANOVA), apabila hasilnya menunjukkan adanya pengaruh yang nyata maka dilakukan uji lanjut Duncan Multiple Range Test (DMRT). Nilai LC 50 diperoleh dari hasil uji toksisitas metode BSLT yang diolah secara statistik menggunakan Probit Analysis.