Penetapan kadar/potensi antibiotik dengan cara mikrobiologi. Slamet Ibrahim Marlia Singgih School of Pharmacy ITB

Transkripsi

1 Penetapan kadar/potensi antibiotik dengan cara mikrobiologi Slamet Ibrahim Marlia Singgih School of Pharmacy ITB

2 Pendahuluan Antibiotik : sintetik, semi-sintetik Kasus retensi mikroba patogen menaikkan dosis nya atau mengganti dengan antibiotik baru banyak penemuan2 antibiotik baru, sehingga perlu ditetapkan potensi nya

3 Acuan Farmakope Indonesia CLSI USP (United States Pharmacopoeia), EP (European Pharmacopoeia), BP (British Pharmacopoeia), JP (Japanese Pharmacopoeia), AOAC (American Association of Analytical Chemists), US-CFR (Code of Federal Registry) and a custom single plate method.

4 Skrining antimikroba dari mikroorganisme di alam

5 Pengertian kadar vs potensi Kadar jumlah per satuan berat/volume Potensi ukuran kekuatan /daya hambat atau daya bunuh zat aktif terhadap mikroorganisme tertentu

6 Mengapa harus dengan cara mikrobiologi? Respons mikroba terhadap antibiotik berbeda-beda Spesifik Sensitif

7 Metode penetapan potensi suatu senyawa Antibiotik Hormon Vitamin

8 Penetapan Potensi Antibiotik Secara Mikrobiologi Dilakukan untuk senyawa antibiotik baru atau untuk tujuan konfirmasi Tidak semua antibiotik ditentukan potensinya secara mikrobiologi Penetapan dilakukan terhadap Bahan baku dan sediaan

9 Prinsip uji potensi antibiotik berdasarkan Farmakope Indonesia edisi IV 1995 Estimasi dari potensi antibiotik melalui perbandingan langsung antara sampel (antibiotik uji) dengan antibiotik standar yang telah disahkan penggunaannya, terkalibrasi dengan baik, dan umum digunakan sebagai rujukan.

10 Metode Umum 1. Lempeng (silinder / kertas cakram) 2. Turbidimetri (tabung)

11

12 Metode Lempeng Silinder Difusi antibiotik dari silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petri atau lempeng yang berisi biakan mikroba uji pada jumlah tertentu Mikroba dihambat pertumbuhannya

13

14

15 Desain pengujian 5+1 Larutan baku pembanding yang dibuat pengenceran S1, S2, S3, S4 dan S5 dengan tingkat perbandingan 1,25. Dosis tengah ditetapkan dulu, misalnya 10 IU/mL, maka: S2=8,0 IU/mL, S1=6,4 IU/mL, S4=12,5 IU/mL dan S5=15,6 IU/mL

16 Dosis baku Dosis sampel

17 Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam selinder atau serapkan pada kertas cakram sebanyak 100 μl di atas media agar yang telah diinokulasikan mikroba uji. Pre-inkubasi selama 1 jam, lalu inkubasi pada ºC selama jam. Setelah masa inkubasi, daerah hambat yang terbentuk diukur garis tengahnya.

18 Pola letak uji pada desain (5+1) S1 S3 S2 S3 S4 S3 Dosis S3 Dosis lainnya S3 S3 S5 U

19 Desain pengujian (5+1) Sebelum menghitung potensi, dilakukan terlebih dahulu koreksi garis tengah ratarata diameter daerah hambat dosis larutan baku S1, S2, S4 dan S5 Cara :

20 Hitung diameter rata-rata S3 di semua cawan (Y 3T ) Hitung diameter rata-rata S3 pada masingmasing cawan larutan baku S1,2,4 dan 5 (Y 31, Y 32, Y 34 dan Y 35 ) Hitung diameter S1,2,4 dan 5 (Y 1, Y 2, Y 4 dan Y 5 )

21 Maka diameter koreksi masing-masing larutan baku adalah : S1 (a) = Y 1 + (Y 3T Y 31 ) S2 (b) = Y 2 + (Y 3T Y 32 ) S3 (c) = Y 3T S4 (d) = Y 4 + (Y 3T Y 34 ) S5 (e) = Y 5 + (Y 3T Y 35 )

22 Untuk kurva baku, dihitung diameter dosis terendah dan tertinggi yaitu : YR = YT = (3a + 2b + c e ) 5 (3e + 2d + c a ) 5 YR = diameter hambat dosis terendah YT = diameter hambat dosis tertinggi

23 Selanjutnya dibuat kurva baku pada kertas semilog : Sumbu X : log dosis Sumbu Y : diameter hambat Hubungkan titik-titik untuk S1 (YR) sampai S5 (YT)

24 Cara Perhitungan potensi sampel Sebelum Perhitungan potensi sediaan uji, dilakukan koreksi diameter larutan sampel U: Y U koreksi = Y S + (Y U Y 3U ) Y 3U = diameter rata-rata S 3 pada pengujian larutan U Y U = diameter rata-rata U pada cawan larutan U Y S = Hasil interpolasi S 3 pada kurva baku

25 Perhitungan Potensi sampel Potensi sediaan uji ditentukan dengan menginterpolasi Y U pada sumbu Y ke garis kurva baku dan tarik garis ke sumbu X (diperoleh X U ) Dosis U = X U /S3 x dosis S3 Potensi U = dosis U x faktor pengenceran

26 Linearity (Kelinieran) (lanjutan) Perhitungan Kadar Diameter Hambat x x x x x Log Ci a. Menggunakan persamaan garis D = b log C + a log Cs = Ds a/ b dimana : Cs = kons. analit dlm sampel Ds = Diameter hambat b. Menggunakan satu larutan baku dan larutan blangko log Cs = (Ds a)/(db a). log Cb dimana : Cb = kons. analit dlm lar.baku

27 mm Membandingkan hasil pengukuran diameter hambat Limit value DIFFERENT SAME

28 Interpretasi hasil

29 Pengukuran diameter hambat

30 Contoh hasil uji potensi antibiotik

31 Contoh BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1. Published online 2009 January 16. doi: / PMCID: PMC Copyright 2009 Zuluaga et al; licensee BioMed Central Ltd. Application of microbiological assay to determine pharmaceutical equivalence of generic intravenous antibiotics Andres F Zuluaga, 1,2 Maria Agudelo, 1 Carlos A Rodriguez, 1,2 and Omar Vesga 1,3 1 GRIPE: Grupo Investigador de Problemas en Enfermedades Infecciosas, University of Antioquia, Medellín, Colombia 2 Department of Pharmacology and Toxicology, University of Antioquia, Medellin, Colombia 3 Section of Infectious Diseases, Department of Internal Medicine, University of Antioquia, Medellin, Colombia Corresponding author. Andres F Zuluaga: andreszuluaga@une.net.co ; Maria Agudelo: mariaag10@yahoo.com ; Carlos A Rodriguez: andreios@yahoo.com ; Omar Vesga: omar.vesga@siu.udea.edu.co Received June 14, 2008; Accepted January 16, 2009.

32 Metode Pengujian dilakukan berdasarkan variasi konsentrasi terhadap efek inhibisi pada bakteri uji : Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538p dan Staphylococcs epidermidis ATCC 12228, yang ditumbuhkan pada media agar (Difco Antibiotic Media), menghasilkan hubungan linear antara konsentrasi zat -respons e linear dengan dua parameter : y-intercept (concentration) and slope (potency). Dibandingkan dua parameter tersebut dari 22 product generik (amikacin 4, gentamicin 15, and vancomycin 3 produk) dengan sediaan pembanding by Overall Test for Coincidence of the Regression Lines (Graphpad Prism 5.0).

33 Pengolahan data dalam proses validasi Ditentukan linearity, limit of quantification, precision, accuracy, dan specificity utk menvalidasi method for testing pharmaceutical equivalence. Untuk tujuan tersebut, log-transformed concentrations (x-axis, log 10 mg/l) dari setiap produk diplot terhadap masing-masing diameter hambat nya (y-axis, rata-rata diameter dalam mm); intercept (perpotongan dan kemiringan/slope garis regresi linear yang diekspresikan dengan persamaan y = b + mx, dengan b sebagai nilai y- intercept dan m sebagai nilai kemiringan nya

34 5 Konsentrasi yang digunakan untuk masingmasing antibiotik : mg/l (amikacin), mg/l (gentamicin), dan mg/l (vancomycin) The goodness of fit to the model (linearity) : dinyatakan dalam coefficient of determination (r 2 ) dan standard error of estimate (S yx ). Dihitung pula x-intercept (log 10 mg/l) dan kemiringan garis regresi dengan kepercayaan 95% confidence intervals (95% CI)

35 Results Validasi metode menghasilkan linearitas (r ), precision (intra-assay variation 11%; inter-assay variation 10%), accuracy, and specificity tests, sesuai dengan syarat international pharmacopoeial. Kecuali pada vancomycin yang ditambahkan 25% API (P y-intercept = 0.001), penentuan potensi antibiotik menunjukkan hasil yang ekuivalen. 21 sediaan generik memberikan undistinguishable slopes dan intercepts (P > 0.66). Estimasi potensi antibiotik: amikacin , gentamisin , dan vancomycin %

36 Precision of the vancomycin bioassay Vancomycin concentration (mg/l) Inhibition zone diameters (mean in mm ± SD) Coefficient of variation (%) Intra-day Coefficient of variation (%) Inter-day ± ± ± ± * ± *An outlier value was excluded from the calculations (we only used five data to compute the CV) BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1. Published online 2009 January 16. doi: / Copyright 2009 Zuluaga et al; licensee BioMed Central Ltd.

37 Kurva baku masing2 antibiotik

38 Penetapan nilai potensi antibiotik