UJI KARBOHIDRAT SECARA KUANTITATIF

Transkripsi

1 UJI KARBOHIDRAT SECARA KUANTITATIF

2 Analisa Karbohidrat Uji Kualitatif Uji Kuantitatif o o o o o o o o Uji Molisch Uji Seliwanoff Uji Anthrone Uji Benedict Uji Barfoed Uji Iodin Uji Pembentukan Osason Uji Fehling o o o o Cara Kimiawi Cara Enzimatis Cara kromatografi Cara Optic (fisis)

3 II. Uji Karbohidrat secara Kuantitatif Penentuan karbohidrat dari kelompok polisarida dan oligisakarida, perlu perlakuan pendahuluan, yaitu hidrolisa sehingga diperoleh monosakarida. Hidrolisa Oligo / polisakarida monosakarida (Pati) Asam atau enzim (glukosa) Penentuan monosakarida: kimiawi fisik enzimatik kromatografi

4 Cara kimiawi 1. Metoda oksidasi dengan kupri Dasar : reduksi kuprioksida menjadi kuprooksida karena adanya gula reduksi Reagen : - Reagen Luff (campuran CuSO 4, Na 2 CO 3, dan asam sitrat) - Reagen soxhlet (campuran CuSO 4 dengan K Na tartrat) K-Na tartrat : pencegah pengendapan CuSO 4 dalam reagen

5 kuprioksida - sebagai oksidator - direduksi oleh gula reduksi membentuk kuprooksida (endapan merah bata) Penentuan kuprooksida yang terbentuk: Menimbang setelah dikeringkan Melarutkan kembali, kemudian dititrasi Menentukan selisih kuprioksida sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi Penentuan gula reduksi dalam larutan: Cara luff Schoorl Cara Munson Walker Cara Lane-Eynon

6 Cara Luff Schoorl Yang ditentukan adalah CuO sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi = (titrasi blanko titrasi sampel) Reaksi : R COH + CuO Cu 2 O + R COOH H 2 SO 4 + CuO CuSO 4 + H 2 O CuSO 4 + 2KI CuI 2 + K 2 SO 4 2CuI 2 Cu 2 I 2 + I 2 I 2 + Na 2 S 2 O 3 Na 2 S 4 O 6 + NaI I 2 + amilum : biru

7 Metode oksidasi dengan larutan Ferrisianida alkalis Dasar : reduksi ferisianida ferrosianida oleh gula reduksi. 2K 3 Fe(CN) 6 + 2KI 2K 4 Fe(CN) 6 + I 2 2K 4 Fe(CN) ZnSO 4 K 2 Zn 2 [Fe(CN) 6 ] K 2 SO 4 gula reduksi ditentukan : berdasar I 2 berdasar NaS 2 O 3 untuk titrasi Indikator : amilum (warna biru hilang) K 4 Fe(CN) 6 yang terbentuk dihitung dari selisih antara K 3 Fe(CN) 6 sebelum dan sesudah reaksi reduksi. Perlu dilakukan percobaan standarisasi

8 Metoda Iodometri Kelebihan I2 dititrasi dengan Na 2 S 2 O 3 Reaksi : Sampel Spesifik untuk aldosa, ketosa hanya sedikit yang teroksidasi Harus dihilangkan zat yang dapat bereaksi dengan Iodin : etanol, aseton, mannitol, gliserin, Na laktat, Na format dan Urea

9 Laktosa secara kimiawi 25 ml susu + reagen filtrat 5 ml filtrat + reagen titrasi dengan Na 2 S 2 O 3 48,4 100 Kadar laktosa/100 ml susu = A x x A = (Tb Ts) x N x 0,171 x 5 A = Kadar Laktosa (g/100 ml) Tb = titrasi blanko Ts = titrasi sampel Susu dengan kadar protein = 3,2%, lemak = 3,5% dari 100 ml susu 48,4 ml filtrat

10 Penentuan Sukrosa Langsung dengan Polirimeter/refraktometer Kimia : hidrolisa (tentukan jumlah gula reduksi) C 6 H 12 O 11 + H 2 O C 6 H 12 O 6 + C 6 H 12 O 6 Sukrosa fruktosa glukosa (342) (180) (180) Sukrosa = 0,95 x gula reduksi BM Sukrosa 342 FK = = 2 BM gula reduksi 360 Penting : Cek dulu kemungkinan adanya gula reduksi dalam sampel sebelum hidrolisa.

11 Penentuan pati Prinsip : pati dihidrolisa dengan asam/enzim gula reduksi ditera jumlahnya [C 6 H 10 O 25 ] m + mh 2 O m C 6 H 12 O 6 pati glukosa BM = m.162 BM = 180 m BM pati FK = m. BM gula reduksi m x 162 = = 0,9 m x 180

12 Cara Enzimatis Terutama untuk penentuan gula dalam campuran karena enzim bersifat spesifik Misal: penentuan glukosa dan fruktosa Dasar : glukosa dan fruktosa difosforilasi menjadi glu 6-fosfat (G6P) dan fruktosa-6-fosfat (F6P) dengan bantuan enzim heksokinase dan Adenosin 5-trifosfat (ATP)

13 Glu + ATP G-6-P + ADP Fruk + ATP F-6-P + ADP G-6-P-DH G-6-P + NADP glukonat 6P + NADPH + H + NADPH yang terbentuk setara dengan glukosa yang bereaksi diukur dengan spektrofotometer (λ = 334, 340, 365 nm) PGI F-6-P G-6-P G-6P-DH G-6-P + NADP glukonat-6-p + NADPH + H + Ditera

14 Penentuan Laktosa dan Galaktosa Dasar : Laktosa + H 2 O β galaktosidase Glukosa + β galaktosa Gal DH β galaktosa + NAD asam galatonat + NADH + H+ ditera (I) pada λ= 334, 340, 365 nm

15 C. Cara Khromatografi Khromatografi kertas/tlc : diukur besarnya Rf tiap komponoen karbohidrat Jarak perpindahan molekul zat Rf = Jarak perpindahan pelarut Harga Rf tiap jenis gula tertentu untuk perlakuan yang sama dipengaruhi : - Macam zat pelarut - Ukuran bejana - Suhu - Macam fase tetap/stasioner - Sifat zat yang dianalisa

16 Kromatografi kertas untuk karbohidrat Zat penyangga : kertas yang tersusun oleh selulosa murni (misal: kertas whatman no.1 kecepatan merambat zat sedang), dipotong sesuai kebutuhan. Teteskan sampel (sekecil mungkin), penetesan 3-4 x (tetesan besar terjadi tailing/pemisah tidak sempurna) Masukkan kertas ke dalam wadah berisi pelarut pelarut merambat pada kertas sampai tanda (Solvent front)

17 Identifikasi : Cara fisis : menyinari kertas dengan sinar UV pada λ: nm Kimiawi : semprot dengan larutan kimia misal: -gula reduksi: anilinpthalat, AgNO3 - Larutan khloroglusional dan HCl dapat digunakan -gula non reduksi: naphtoresorcinol dlm asam fosfat. untuk: Aldosa pentosa (violet) Ketosa pentosa (hijau tua) Ketoheksosa (kuning coklat) Metil pentosa (hijau )

18 Uap Iodin Semprotkan pada kertas diruang asam Setelah kering akan timbul noda berwarna Hitung Rf, bandingkan dengan standar Zat pelarut: zat murni atau campuran Untuk penentuan gula sederhana: Campuran butanol : asetat : air atau asam asetat : pyridin : air (4:1:5)

19 Cara fisis (Cara optic) Penentuan index bias dengan refraktometer tiap jenis gula punya index bias tertentu. Keuntungan: interval skala index bias cukup besar 1,30 1,75 sampel sangat sedikit (beberapa tetes) ketelitian : ± 0,0002 dinyatakan dengan 20 n D = pengukuran pada t = 20 o C dengan sinar Natrium sebagai sumber sinar monokromatis.

20 Pengaruh konsentrasi terhadap (α) sangat kecil diabaikan Suhu berpengaruh perlu koreksi : [ ] D [ ] D α = α [ 1 0,000184( t 20) ] t t

21 Penentuan karbohidrat dengan polarimeter Dasar: Karbohidrat bersifat optis aktif (mampu memutar bidang sinar terpolarisasi), karena mempunyai C asimetri Keuntungan Sampel tidak mengalami kerusakan Dapat dilakukan cepat Agar hasil teliti, maka: Larutan harus jernih dan tidak berwarna Larutan tidak mengandung bahan asing yang bersifat optis aktif Konsentrasi sampel yang optimum: tidak terlalu pekat amupun encer

22 Penentuan dengan polarimeter Hukum biot: kapasitas rotasi tiap individu gula sebanding dengan konsentrasi larutan dan panjang cairan dalam tabung [α] t D α C I [ α] D t 100 = lc α : putaran/ritasi spesifik : suhu pengukuran (oc) : sinar Na (589 nm) : sdf putar yang diamati : konsentrasi (g sampel/100 ml pelarut) : panjang tabung (dm)

23 Penentuan Serat Kasar Serat kasar : Senyawa yang tidak dapat dicerna dalam organ pencernaan manusia maupun binatang. Dalam analisa : diperhitungkan banyaknya zat yang tidak larut dalam asam/basa encer pada kondisi tertentu.

24 Langkah penentuan serat kasar 1. Defatting : menghilangkan lemak dalam sampel dengan pelarut lemak 2. Digestion : - pelarutan dengan asam - pelarutan dengan basa dalam keadaan tertutup pada temperatur terkontrol (mendidih) segera dilakukan penyaringan untuk mencegah kerusakan lebih lanjut Protein menyulitkan penyaringan perlu digesti pendahuluan dengan enzim proteolitik Residu = serat kasar yang mengandung 97% selulosa dan lignin sisanya adalah senyawa yang belum dapat diidentifikasi