SKRIPSI. Oleh: ANDI RIZKA FM JURUSAN ILMU KELAUTAN FAKULTAS ILMU KELAUTAN DAN PERIKANAN UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2013

Transkripsi

1 i SKRINING BAKTERI SIMBION SPONS ASAL PERAIRAN PULAU POLEWALI DAN PULAU SARAPPOLOMPO SEBAGAI PENGHASIL ANTIBAKTERI TERHADAP BAKTERI PATOGEN PADA MANUSIA DAN IKAN SKRIPSI Oleh: ANDI RIZKA FM JURUSAN ILMU KELAUTAN FAKULTAS ILMU KELAUTAN DAN PERIKANAN UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2013 i

2 ii RINGKASAN ANDI RIZKA FM. L Skrining Bakteri Simbion Spons Asal Perairan Pulau Polewali dan Pulau Sarappolompo Sebagai Penghasil Antibakteri Terhadap Bakteri Patogen Pada Manusia dan Ikan. Di bawah bimbingan Arniati selaku Pembimbing Utama dan Elmi Nurhaidah Zainuddin selaku Pembimbing Anggota. Meningkatnya penyakit infeksi karena resistensi bakteri terhadap antibiotik komersil yang telah ada, maka diperlukan pencarian antibakteri baru dari alam. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jumlah isolat, sifat antagonis dan patogenitas dari bakteri yang berasosiasi dengan spons, mengetahui potensi antibakteri dari bakteri asosiasi spons terhadap bakteri patogen Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio harveyi, Aeromonas hydrophilla dan jamur Candida albicans serta karakterisasi bakteri. Tahap dari penelitian ini adalah isolasi bakteri dari spons Petrosia sp. asal Pulau Polewali dan Spheciousspongia vagabunda asal Pulau Sarappolompo, Perairan Pangkep. Selanjutnya dilakukan uji patogenitas dengan menggunakan metode blood agar untuk pengujian pada manusia dan metode BSLT untuk pengujian pada hewan budidaya selanjutnya pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar dan karakterisasi dengan metode pewarnaan Gram. Pada penelitian ini ditemukan 15 isolat bakteri asosiasi spons Petrosia sp. dan 3 isolat dari spons Spheciousspongia vagabunda. Dari 18 isolat tersebut, hanya 7 bakteri yang mampu menghambat bakteri patogen dengan uji antagonis. Selanjutnya hasil uji patogenisitas dengan blood agar pada ketujuh isolat bakteri terdapat 4 bakteri yang tidak bersifat patogen ( -hemolisis dan -hemolisis), sedangkan untuk uji patogenisitas dengan metode BSLT tidak ada bakteri yang bersifat patogen. Hasil uji aktivitas antibakteri diperoleh 4 isolat menghambat S.aureus, 2 isolat menghambat E.coli, 2 isolat menghambat V.harveyi dan 1 isolat menghambat A.hydrophilla. Kata kunci: Pulau Polewali, Pulau Sarappolompo, Spons Petrosia sp., spons Spheciousspongia vagabunda, bakteri simbion, antibakteri

3 iii ABSTRACT ANDI RIZKA FM. L Screening of bacterial symbionts sponge from Polewali island and Sarappolompo island as antibacterial activities against human and fish bacterial pathogens with Arniati as primary advisor and Elmi Nurhaidah Zainuddin as secondary advisor. Increased diseases infection by microbial pathogens in both humans and aquaculture organisms cause the need of new antibiotics from natural resources The purpose of this study was to obtain the bacterial symbionts of sponge. Methods of this study include bacterial isolation, antagonistic test, pathogenicity test, antibacterial test of bacterial association sponge againts bacterial pathogen Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio harveyi, Aeromonas hydrophilla and yeast Candida albicans., and characterization of isolates with staining Gram method. The step of the research included bacterial isolation Petrosia sp. from Polewali Island and Spheciousspongia vagabunda from Sarappolompo Island, Pangkep waters. Followed by blood agar method for pathogenicity test of human pathogenic and BSLT method for fish pathogenic then Acitivity antibacterial test with difussion agar method. In this study, 15 isolate were associated with Petrosia sp. and 3 were associated with Spheciousspongia vagabunda. Seven of 18 isolate were found to inhibit pathogens in antagonist test. Four of 7 isolate were non-pathogenic in human ( -hemolisis dan -hemolisis) and all isolate were non-pathogenic in fish. Antibacterial test of 7 isolate showed 4 isolates were active againts S.aureus and each 2 isolate were active againts E.coli and V.harveyi, one isolate were active againts A.hydrophilla. Keywords: Polewali island, Sarappolompo island, spons Petrosia sp., Spheciousspongia vagabunda, Bacterial Symbionts, Antibacterial

4

5 i SKRINING BAKTERI SIMBION SPONS ASAL PERAIRAN PULAU POLEWALI DAN PULAU SARAPPOLOMPO SEBAGAI PENGHASIL ANTIBAKTERI TERHADAP BAKTERI PATOGEN PADA MANUSIA DAN IKAN Oleh: ANDI RIZKA FM SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan JURUSAN ILMU KELAUTAN FAKULTAS ILMU KELAUTAN DAN PERIKANAN UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2013 i

6 ii

7 iii RIWAYAT HIDUP ANDI RIZKA FM. Lahir di Bone-Bone pada tanggal 07 Mei Anak ketiga dari sembilan bersaudara dan merupakan buah kasih sayang dari pasangan Dr.Ir.H.Muchlis Mappangaja,MP dan Hj. Andi Siti Latifah M. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SDN 80 Lalebbata Palopo pada tahun 2001 melanjutkan pendidikan Tsanawiyah di Ma Had Al- Zaytun Indramayu Jawa Barat pada tahun 2004 dan menyelesaikan pendidikan Aliyah di Ma had Al-Zaytun Indramayu Jawa Barat pada tahun Tahun 2008 adalah awal perjuangan penulis untuk meraih gelar S1 Ilmu Kelautan Universitas Hasanuddin Makassar dengan mengikut jalur SPMB. Penulis menyelesaikan rangkaian tugas akhir, masing-masing mengikuti Kuliah Kerja Nyata (KKN) di Desa Waetuoe Kec. Lanrisang Kab. Pinrang Gelombang 82 pada Juni - Agustus 2012 dan Praktek Kerja Lapang (PKL). Sebagai tugas akhir, penulis melakukan penelitian dengan judul Skrining Bakteri Simbion Spons Asal Perairan Pulau Polewali dan Pulau Sarappolompo Sebagai Penghasil Antibakteri Terhadap Bakteri Patogen Pada Manusia dan Ikan.

8 iv KATA PENGANTAR Assalamu Alaikum Wr.Wb. Segala puji penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan nikmat-nya, Shalawat dan salam juga tercurahkan kepada Nabiullah Muhammad SAW. Alhamdulillah atas izin dan petunjuk-nya skripsi ini dapat terselesaikan. Pepatah Tak ada gading yang tak retak laksana cermin bagi skripsi ini.karena penulis adalah manusia yang tak luput dari kesalahan.untuk itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang sifatnya membangun dari semua pihak. Selesainya skripsi ini tentunya tidak lepas dari doa, dukungan dan bantuan banyak pihak kepada penulis. Untuk itu dengan penuh ketulusan dan kerendahan hati penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih yang setinggitingginya kepada : 1. Pembimbing utama Dr. Arniati M.Si dan pembimbing anggota Dr.rer.nat. Elmi Nurhaidah Zainuddin,DES yang senantiasa meluangkan waktu untuk membimbing berupa masukan-masukan demi kesempurnaan skripsi ini. 2. Penguji Dr. Ir. Abdul Haris, M.Si, Prof. Dr. Ir. Jamaluddin Jompa, M.Sc, dan Drs. Sulaiman Gossalam, M.Si, serta panitia seminar hasil dan ujian skripsi Supriadi, ST.M.Si dan Dr. Khairul Amri, ST, M.Sc. Stud. 3. Ketua Jurusan Ilmu Kelautan dan Perikanan Dr. Ir. Amir Hamzah Muhiddin, M.Si dan Dr. Ir. Marzuki Ukkas, DEA yang selalu memberikan masukan dan solusi bagi penulis 4. Terkhusus kepada kedua orang tua, Ayahanda Dr.Ir.H. Muchlis Mappangaja, MP dan Ibunda Hj. Andi Siti Latifah M yang tercinta yang selalu mendoakan dengan tulus dan penuh kasih sayang, mendukung langkah kemajuan ananda. Untukmu terucap terima kasihku yang sangat mendalam. 5. Kepada Kakak dan adik penulis, Andi Muthmainnah, Andi Naimah, Andi Raehana, Andi Syakur, Andi Fathur, Andi Ghafur, Andi Farha dan Andi farouq yang selama ini selalu memberikan dukungan dan motivasi kepada penulis serta kepada seluruh keluarga yang selama ini selalu mendoakan keberhasilan penulis.

9 v 6. Buat sahabat-sahabatku Atrasina Adlina, S.Kel, Darmiati S.Kel, Nur Ipa S.Kel, Rabuanah, S.Kel yang selalu mendukung dan menyemangati penulis serta selalu ada disaat susah maupun senang. Kalian adalah teman terbaik yang pernah ada. 7. Kepada teman-teman seperjuangan Mezeight, Anggy, Hardianty, Haska, Anti aras, Emma Rosdiana, Uswatun Hasanah, Rosdiana, Siti Syamsinar, Rara, M. Arifuddin, Januar Triadi, Fikruddin, Rahmadi, Ahmad Faisal, Andri Purnama Putra, Haerul, Anto Samin, Anto kopas, Auliansyah, Nikanor, Halid, Adi dan semua teman-teman yang tidak mungkin disebutkan satu persatu, terima kasih atas kerja sama dan dukungannya dalam mengarungi suka duka perkuliahan. 8. Terspesial buat Syahrul Ridwan,S.Pd yang selama ini mendampingi, memotivasi dan memberikan arahan kepada penulis dalam menyelesaikan skipsi ini 9. Staf dan laboran Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, dan kepada Nur Haslina S.Pi, Eka Lisdayanti S.Kel, Musdalifah S.Kel, Nurfadilah S.Kel, Mahatir dan semua yang hadir dan memberikan bantuan kepada penulis selama mengerjakan penelitian sampai selesai terima kasih atas semuanya. 10. Terakhir kepada semua pihak yang telah memberikan dukungan moril materil, sumbang saran dan inspirasi-inspirasi berharga yang namanya tidak dapat disebutkan satu-persatu ku ucapkan rasa terima kasih yang tulusdan penghargaankepada semuanya. Sebuah asa dari kami bahwaisi tulisan ini dapat bermanfaat bagi kita semua khususnya bagi penulis, semoga karya tulis ini dapat bermanfaat dan ikut berperan dalam pendidikan. Amien... Billahi Fii Sabilil Haq, Fastabiqul Khaerat. Wassalamu Alaikum Warahmatullah Wabarakatuh. Makassar, 5 September 2013 Penulis Andi Rizka Fitrah Muchlis

10 vi DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... viii DAFTAR GAMBAR... ix DAFTAR LAMPIRAN... x I. PENDAHULUAN... 1 A. Latar Belakang... 1 B. Tujuan dan Kegunaan... 3 II. TINJAUAN PUSTAKA... 4 A. Aspek Bioekologi Spons... 4 B. Spons Petrosia sp. dan Spheciousspongia vagabunda... 6 C. Bakteri Laut... 6 D. Bakteri Simbion Spons Penghasil Senyawa Antibakteri E. Bakteri Patogen Pada Organisme Budidaya dan Manusia F. Parameter Lingkungan G. Uji Patogenitas III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat B. Alat dan Bahan C. Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel Spons Sterilisasi Peralatan Pembuatan dan Sterilisasi Media Isolasi Bakteri Simbion Spons Uji Antagonis Terhadap Bakteri Patogen Daya Toksik Isolat Bakteri Simbion Spons (Patogenitas) Pengujian Aktivitas Antibakteri Dengan Metode Difusi Agar Pengujian Gram Bakteri Isolat Simbion Spons D. Analisis Data IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Isolat Bakteri Simbion Spons B. Kemampuan Isolat Bakteri Simbion Spons Sebagai Antibakteri C. Daya Toksik Isolat Bakteri Simbion Spons (Patogenitas)... 31

11 vii 1. Uji BSLT (brine shrimp lethality test) Uji Blood Agar D. Aktivitas Antibakteri Terhadap Bakteri Patogen Manusia Dan Organisme Budidaya Bakteri Patogen Manusia Patogen Organisme budidaya A. hydrophilla E. Karakterisasi Bakteri V. SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan B. Saran DAFTAR PUSTAKA... 40

12 viii DAFTAR TABEL No Halaman 1. Alat yang digunakan dalam penelitian Morfologi koloni bakteri simbion spons yang berasal dari Pulau Polewali dan Pulau Sarappolompo Hasil uji Antagonis isolat bakteri simbion terhadap beberapa bakteri patogen Nilai LC 50 (24 Jam) Hasil analisis probit masing-masing isolat bakteri simbion dari spons Hasil Uji Toksisitas isolat bakteri simbion spons dengan Metode Blood Agar Nilai Rata-Rata diameter zona hambat isolat kandidat bakteri simbion terhadap E.coli dan Staphylococcus aureus Nilai Rata-Rata diameter zona hambat isolat kandidat bakteri simbion terhadap Aeromonas hydrophilla dan Vibrio harveyi Hasil pewarnaan gram isolat bakteri simbion spons... 38

13 ix No DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Struktur sel spons yang paling sederhana Bentuk sel bakteri Staphylococcus aureus Bentuk sel bakteri Escherichia coli Bentuk sel bakteri Aeromonas hydrophilla Bentuk sel bakteri Vibrio harveyi Peta lokasi pengambilan sampel spons di kabupaten Pangkep Skema kerja isolasi bakteri Skema kerja metode uji patogenisitas Skema kerja untuk pengujian aktivitas antibakteri Koloni bakteri simbion spons pada medium TSA Spons Petrosia sp Spikula oxea dari spons Petrosia sp

14 x DAFTAR LAMPIRAN No Halaman 1. Hasil Isolasi dan kultur bakteri simbion spons Petrosia sp Hasil Uji BSLT (brine shrimp lethality test) isolat bakteri simbion Hasil analisis one-way ANOVA isolat bakteri simbion terhadap bakteri patogen manusia Hasil analisis one-way ANOVA isolat bakteri simbion terhadap bakteri patogen organisme budidaya Morfologi sel isolat bakteri simbion spons Petrosia sp... 50

15 1 I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Pulau Sarappolompo dan Pulau Polewali merupakan pulau yang masuk dalam gugusan Kepulauan Spermonde yang secara administratif masuk wilayah Kecamatan Liukang Tupabbiring, Kabupaten Pangkep. Pada perairan Pulau Sarappolompo dan Pulau Polewali ditemukan berbagai sumberdaya alam laut yang dapat dimanfaatkan oleh manusia, baik berupa bahan makanan, atau bahan obat-obatan seperti antibakteri, antijamur, antioksidan dan sebagainya. Salah satu sumberdaya alam laut yang ditemukan pada ke dua pulau tersebut adalah spons. Spons adalah hewan berpori yang termasuk filter-feeder yaitu hewan yang memiliki cara makan dengan menyaring air laut yang mengandung makanan melalui pori-pori (ostium). Makanan porifera berupa mikroorganisme atau sisa organisme mati yang berada di kolom air. Menurut Taylor dkk. dalam Abubakar (2011). Selain sebagai makanan mikroorganisme juga dapat menjadi simbion dengan menggunakan tubuh spons sebagai inangnya, untuk tempat hidup dan perlindungan. Sedangkan mikroorganisme dapat memberikan kontribusi untuk pertahanan inangnya dengan eksresi antimikroba dan substansi bioaktif lainnya. Organisme laut yang sesil seperti spons diperkirakan sangat bergantung pada mekanisme pertahanan kimia untuk melawan hewan-hewan predator dan perlekatan dari mikroorganisme patogen. Thomas (2010) menyatakan terdapat sepuluh filum bakteri yang bersimbiosis dengan spons yaitu Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria dan Verrucomicrobia. Bakteri yang bersimbiosis dengan spons menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang aktif berpotensi sebagai 1

16 2 antibakteri patogen Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis dan Vibrio eltor (Muniarsih dan Rasyid, 2010). Selanjutnya Lee dkk. (2001) menyatakan bahan alam yang dihasilkan oleh bakteri simbion adalah jenis senyawa chlorinated, Neuroactive, Antimicrobial yang dapat digunakan sebagai bahan baku obat antibiotik. Berbagai jenis bakteri patogen terhadap manusia diantaranya ialah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli, sedangkanbakteri patogen organisme budidaya diantaranya ialah Vibrio harveyi dan Aeromonas hydrophilla. Staphylococcus aureus merupakan salah satu bakteri yang resisten terhadap beberapa jenis antibiotik terutama golongan β-lactam seperti vancomysin (Hastari, 2012). Bakteri patogen E.coli adalah salah satu jenis bakteri yang secara normal hidup dalam saluran pencernaan baik manusia maupun hewan yang sehat dan merupakan strain penyebab beberapa jenis diare pada manusia. Gangguan penyakit pada budidaya ikan juga menjadi masalah di dunia budidaya laut yang meliputi infeksi dan non-infeksi. Penyakit infeksi disebabkan oleh serangan patogen, seperti virus, bakteri, jamur dan parasit (Rume dkk., 2011). Jenis bakteri patogen yang banyak menimbulkan penyakit pada organisme budidaya diantaranya adalah dari genus Aeromonas sp. dan Vibrio sp. Aeromonas hidrophila merupakan bakteri yang menyebabkan penyakit Motile Aeromonas Septicemia (MAS) atau Haemorrhagic Septicemia yang menyerang ikan air tawar (Ismail dkk., 2002), sedangkan Vibrio sp. menyebabkan penyakit vibriosis yang sering menyerang udang maupun ikan (Rinawati, 2010). Antibiotik telah banyak ditemukan baik sebagai antijamur, antibakteri, antivirus, antitumor bahkan sebagai antikanker. Namun dengan penggunaan berulang-ulang dapat meningkatkan resistensi terhadap bakteri patogen, untuk itu perlu pencarian suatu antibakteri yang mampu menghambat dan membunuh

17 3 bakteri patogen dan perlu diadakan suatu penelitian tentang pencarian bahan bioaktif yang baru (Zainuddin dkk., 2010). Berdasarkan hal tersebut diatas maka perlu dilakukan penelitian skrining bakteri simbion sponsasal dari perairan Pulau Polewali dan Pulau Sarappolompo yang diharapkan dapat digunakan sebagai antibakteri patogen pada manusia dan ikan. B. Tujuan dan Kegunaan Tujuan dari penelitian ini adalah: 1. Mendapatkan isolat bakteri simbion spons yang berasal dari perairan Pulau Sarappolompo dan Pulau Polewali 2. Menganalisis antagonisme dan patogenitas isolat bakteri simbion spons 3. Mengetahui aktivitas antibakteri dari bakteri simbion spons terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Aeromonas hydrophilla, dan Vibrio harveyi Kegunaan dari penelitian ini adalah sebagai informasi dan bahan masukan tentang antibakteri yang berasal dari bakteri asosiasi spons terhadap bakteri patogen pada organisme budidaya dan manusia.

18 4 II. TINJAUAN PUSTAKA A. Aspek Bioekologi Spons Spons merupakan biota laut yang tersebar mulai dari perairan laut dangkal hingga kedalaman 5,5 km. Spons atau Porifera termasuk hewan multi sel yang mana fungsi jaringan dan organnya masih sangat sederhana. Hewan ini hidupnya menetap pada suatu habitat pasir, batu-batuan atau juga pada karangkarang mati di dalam laut. Adapun karakteristik spons secara umum adalah memiliki bentuk tubuh yang tidak simetris, tubuh terdiri atas banyak sel, sedikit jaringan dan tidak ada organ tubuh.sel dan jaringan mengelilingi suatu ruang yang berisi air tetapi sebenarnya tidak memiliki rongga tubuh, dan tidak memiliki sistem saraf. Semua spesies spons bersifat sesil sebagai organisme dewasa, sedangkan pada tahap larva bersifat planktonik (Ramli, 2010). Spons adalah hewan berpori yang termasuk filter feeder yaitu hewan dalam mencari makanan aktif menghisap dan menyaring air yang melalui seluruh permukaan tubuhnya. Hal ini dapat dicontohkan pada pada bentuk spons yang memiliki kanal internal yang paling sederhana (Gambar 1), dimana dinding luarnya (pinakodermis) mengandung pori-pori (ostia). Melalui ostia inilah air dan materi-materi kecil yang terkandung di dalamnya dihisap dan disaring oleh sel-sel berbulu cambuk atau sel kolar (choanocytes), kemudian air tersebut dipompakan keluar melalui lubang tengah (oskulum). Sistem pengisapan dan penyaringan air terjadi juga pada spons yang memiliki kanal internal yang lebih rumit, dimana sistem aliran air tersebut melalui beberapa sel kolar sebelum keluar melalui oskulum (Amir dan Budiyanto, 1996). Arus air yang lewat melalui spons membawa serta zat buangan dari tubuh spons, maka penting agar air yang keluar melalui oskulum dibuang jauh dari

19 5 badannya, karena air ini tidak berisi makanan lagi, tetapi mengandung asam karbon dan sampah nitrogen yang beracun bagi hewan tersebut sehingga penting bagi spons untuk hidup dalam air bersirkulasi (Romimohtarto dan Juwana dalam Amir dan Budiyanto 1996). Gambar1. Struktur sel spons yang paling sederhana; a) oskulum; b) sel penutup; c) sel amoebosit; d) sel pori (porosity); e) pori saluran masuk (ostia); f) telur; g) spikula triaxon; h) mesohil; i) sel mesenkin; j) bulu cambuk (flagella); k) sel kolar (choanocytes); l) sklerosit; dan m) spikula monoaxon (Amir dan Budiyanto, 1996). Morfologi luar spons sangat dipengaruhi oleh faktor fisik, kimiawi dan biologis lingkungannya. Spesimen yang berada di lingkungan yang terbuka dan berombak besar cenderung pendek pertumbuhannya atau juga merambat. Sebaliknya spesimen dari jenis yang semua pada lingkungan yang terlindung atau pada perairan yang lebih dalam dan berarus tenang. Pertumbuhannya cenderung tegak dan tinggi (Bergquist dalam Amir dan Budiyanto, 1996). Spons tumbuh melekat pada terumbu karang dan dasar laut. Binatang lunak dengan variasi warna, bentuk, dan ukuran ini tidak dapat berpindah seperti halnya ikan dan binatang laut lainnya. Untuk mempertahankan diri dari predator,

20 6 spons memiliki senjata perisai berupa senyawa kimia membentuk metabolit sekunder, yang ditakuti dan dihindari predator karena beracun. Lokasi yang lebih terlindung memiliki spesies yang jumlahnya lebih rendah dibandingkan dengan lokasi yang lebih terbuka pada daerah karang yang dikarenakan tingginya jumlah pasir pada daerah lereng karang yang menawarkan sedikit substrat yang layak bagi spons. Kebanyakan spons memiliki cakupan distribusi yang luas mengarah ke shelf, sedangkan beberapa spesies terbatas spesifik pada daerah karang dan kedalaman tertentu. B. Spons Petrosia sp. dan Spheciousspongia vagabunda Spons Petrosia sp. yang diambil pada kedalaman ±10-20 m dari Pulau Polewali berwarna coklat kemerahan. Karakter spons berkonsistensi keras yaitu permukaannya seperti kayu. Spons ini tidak dapat ditekan karena tekstur dalamnya yang keras. Karakteristik saat robek/rusak ialah Tough yaitu tahan terhadap robekan. Permukaan spons ini bersih, tidak memiliki garis-garis (uneven) dengan fill seperti kulit (lethery) dan proyeksinya ialah smooth yaitu tidak ada rambut Spons Spheciousspongia vagabunda diambil pada kedalaman ±10-20 m dari Pulau Sarappolompo. Warna spons ini coklat kemerahan, bentuknya encrusting, konsistensinya keras dengan reaksi jika disentuh tergolong firm, karakteristik spons ini tough dengan permukaan tergolong even dan proyeksinya oscular chimneys (Haris, 2013) C. Bakteri Laut Di laut bakteri mendominasi kehidupan sehingga bakteri dapat dijumpai dimana saja dibagian laut. Bakteri di laut mempunyai peranan yang sangat penting di dalam menjaga kesinambungan kehidupan laut karena bakteri mempunyai kemampuan untuk mendegradasi senyawa organik menjadi senyawa

21 7 anorganik (nutrisi). Nutrisi ini kemudian menjadi sumber makanan bagi produktifitas primer yaitu fitoplankton dan protozoa yang merupakan piramida dasar dari rantai makanan di laut. Pemeriksaan secara acak terhadap berbagai koloni dan pengamatan mikroskopis langsung menunjukkan bahwa 95% bakteri laut bersifat Gram negatif. Bakteri laut sebagian besar bergerak secara aktif. Antara 75-85% sediaan murni yang diamati memiliki flagela. Diperkirakan kemampuan bergerak ini sebagai hasil adaptasi kehidupan perairan. Bakteri laut 70% mengandung pigmen dan mempunyai toleransi yang besar terhadap suhu tinggi (Pelczar dan Chan, 1986) Bakteri laut mempunyai kemampuan mencerna hampir semua senyawa organik dan sebagian besar senyawa anorganik akan mengalami perubahan akibat kegiatan bakteri laut. Secara umum bakteri laut lebih kuat dalam hal mencerna protein daripada karbohidrat. Perlu diketahui pula bakteri laut sangat peka terhadap turun atau naiknya salinitas larutan. Kebutuhan akan salinitas menunjukkan bahwa bakteri dari lingkungan berbeda memiliki toleransi garam dan kemampuan aklimasi tekanan osmosis yang berbeda pula. Sebagian besar bakteri yang mungkin diperkirakan kontaminan merupakan bakteri laut (Sidharta, 2000). Bakteri mampu berinteraksi dengan berbagai organisme laut, sehingga tidak ada satupun organisme laut yang bebas dari interaksi dengan bakteri. Salah satu bentuk interaksi bakteri ialah interaksi hubungan trofik yaitu interaksi bakteri baik yang hidup bebas maupun yang berada dalam partikel merupakan sumber makanan organisme laut mulai dari ciliata, spons, coelenterata hingga polychaeta, molusca, crustacea, holothurian dan tunicata. Mikroorganisme laut, seperti halnya makhluk hidup lainnya, sangat dipengaruhi oleh faktor-faktor abiotik (fisik dan kimia) lingkungan sekitarnya.

22 8 Faktor tersebut tidak saja mempengaruhi keberadaan suatu jenis mikroba dalam laut, tapi juga mempengaruhi pertumbuhan, perbanyakan dan kegiatan-kegiatan yang penting bagi organisme lain. Faktor-faktor tersebut antara lain ialah: 1. Suhu Suhu air laut berkisar antara -2 hingga 45 o C yakni mulai dari suhu air laut daerah kutub sampai air laut di daerah tropis (perairan dangkal). Semua proses pertumbuhan bakteri bergantung pada reaksi kimiawi yaitu laju reaksi yang dipengaruhi oleh suhu. Keragaman suhu dapat mengubah proses metabolisme tertentu selain morfologi dari sel bakteri. Bakteri laut pada 37 o C akan terbunuh sebanyak 42%, sedang pada suhu 45 o C hanya tinggal 15% sel yang akan bertahan hidup. Pertumbuhan dan perbanyakan bakteri laut mencapai optimum pada suhu 18 o C (Sidharta, 2000) 2. Derajat Kemasaman (ph) Sebagian besar bakteri memiliki nilai ph minimum dan maksimum antara 4 dan 9 dalam pertumbuhannya. Pada umumnya ph optimum pertumbuhan bakteri terletak antara 6,5 dan 7,5. Namun, beberapa spesies dapat tumbuh dalam keadaan asam atau basa (Pelczar dan Chan, 1986). 3. Keberadaan Oksigen Kebutuhan oksigen pada bakteri tertentu mencerminkan mekanisme yang digunakan untuk memenuhi kebutuhan energinya. Berdasarkan kebutuhan oksigen tersebut, bakteri dapat dipisahkan menjadi: Anaerob; bakteri yang tidak perlu oksigen dalam metabolismenya dimana donor elektron diperoleh dengan memanfaatkan sumber lain selain oksigen. Aerob obligat, anaerob obligat; bakteri yang tidak dapat menyesuaikan diri dengan kedua situasi.

23 9 Pada anaerob toleran dan obligat, metabolismenya bersifat fermentatif kuat. Pada anaerob fakultatif metabolisme respirasi dilakukan jika tersedia oksigen, tetapi tidak terjadi fermentasi. Pada saat bakteri tumbuh dalam keadaan terdapat udara, terjadi sejumlah reaksi enzimatik dan mengakibatkan produksi hidrogen peroksida dan radikal superoksida 4. Tekanan Osmosis Diketahui bahwa membran untuk semua organisme bersifat semipermeable.membran sel memperbolehkan air untuk berpindah melalui mekanisme osmosis antara sitoplasma dan lingkungan luar. Bakteri memiliki dinding sel yang kaku yang dapat menahan perubahan tekanan osmotik, sehingga biasanya tidak menunjukkan perubahan bentuk ataupun ukuran yang menyolok bila terjadi plasmolisis atau plasmoptisis. 5. Faktor Nutrisi Kebutuhan nutrisi bagi mikroba terdiri dari substrat (sumber energi dan karbon) untuk pembentukan sel baru dan elemen anorganik (nutrien) serta faktor pertumbuhan (nutrien organik) (Shuler dan Kargi, 1992). Nutrien (elemen anorganik) yang terutama (macro nutrient) yang dibutuhkan mikroorganisme adalah N, S, P, K, Mg, Ca, Fe, Na dan CI. Sedangkan nutrien lain yang juga dibutuhkan dalam jumlah relatif tidak terlalu besar (micro nutrient) termasuk Zn, Mn, Mo, Se, Co, Cu, dan Ni. Adakalanya mikroorganisme juga membutuhkan nutrien organik, yang lebih dikenal dengan faktor pertumbuhan. Faktor pertumbuhan adalah senyawa yang dibutuhkan mikroorganisme sebagai unsur pokok materi organik sel yang tidak dapat dibentuk dari sumber karbon lain (Shuler dan Kargi, 1992). Kebutuhan faktor pertumbuhan berbeda untuk setiap mikroorganisme. Namun faktor pertumbuhan utama dapat diklasifikasikan sebagai asam amino, purin dan pirimidin, serta vitamin.

24 10 D. Bakteri Simbion Spons Penghasil Senyawa Antibakteri Spons hidupnya bersimbiosis dengan beranekaragam jenis bakteri. Bakteri yang bersimbiosis dengan organisme kemungkinan besar banyak melakukan interaksi biokimia dengan organisme inangnya. Interaksi biokimia tersebut memungkinkan bakteri yang bersimbiosis menghasilkan zat bioaktif yang sama dengan inangnya. Sehingga beberapa jenis bakteri yang bersimbiosis dengan spons diperkirakan dapat menghasilkan senyawa senyawa bioaktif yang dapat digunakan sebagai bahan antibakteri (Pastra, 2011). Bakteri yang memiliki kemampuan antimikroba dapat menghasilkan senyawa antimikroba. Senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri pada umumnya merupakan metabolit sekunder yang tidak digunakan untuk proses pertumbuhan (Schlegel, 1993), tetapi untuk pertahanan diri dan kompetisi dengan mikroba lain dalam mendapatkan nutrisi, habitat, oksigen, cahaya dan lain-lain (Baker dan Cook, 1974). Adanya hubungan antara produksi antibakteri oleh mikroba simbion dengan spons telah diteliti oleh Narsinha dan Anil (2000), yang melaporkan bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri simbion spons sangat dipengaruhi oleh like-protein rekombinan yang terdapat pada biota inang Suberitas domuncula. Penelitian tersebut memperkuat adanya hubungan kerjasama dalam biosintesa metabolit sekunder antara mikroba simbion dengan spons. E. Bakteri Patogen Pada Organisme Budidaya dan Manusia Bakteri patogen merupakan bakteri yang menyebabkan penyakit pada manusia, hewan, dan juga pada tumbuhan (Pelczar dan Chan, 1988). Beberapa jenis bakteri patogen yang umum menjadi penyebab masalah kesehatan manusia, yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis dan Escherichia coli.

25 11 Sedangkan beberapa bakteri patogen pada organisme budidaya ialah Aeromonas hydrophilla, Vibrio alginolyticus dan Vibrio harveyi 1. Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram-positif penyebab infeksi (membentuk nanah) dan bersifat toksik bagi manusia. Gambar 2. Bentuk sel bakteri Staphylococcus aureus Hal ini menyebabkan berbagai masalah pada kulit seperti bisul, hordeolum, bahkan masalah serius seperti pneumonia, mastitis, meningitis, dan infeksi saluran kemih (Todar, 2011). 2. Escherichia coli Escherichia coli hidup dalam saluran pencernaan manusia dan organisme lainnya. Penyakit pada manusia akibat Escherichia coli terjadi ketika adanya kontaminasi dari air yang digunakan. Infeksi Escherichia coli juga dapat terjadi karena memakan makanan yang belum matang, kontaminasi pada daging, maupun pada susu yang belum dipasteurisasi (Belk dan Maier, 2010). Gambar 3. Bentuk sel bakteri Escherichia coli

26 12 3. Aeromonas hydrophilla Aeromonas hydrophilla merupakan bakteri yang distribusinya luas yang dapat ditemukan pada air tawar maupun pada air laut. Bakteri ini termasuk bakteri Gram-negatif, motil dan berbentuk batang. Aeromonas hydrophilla dapat menyebabkan penyakit Motile Aeromonas Septicemia (MAS), red-spot disease penyakit tukak atau bercak merah pada ikan air tawar. Ikan yang diserang bakteri ini mempunyai daya kelangsungan hidup yang rendah (Badjoeri, 2008). Gambar 4. Bentuk sel bakteri Aeromonas hydrophilla 4. Vibrio harveyi Vibrio harveyi merupakan bakteri patogen pada ikan dan udang laut yang paling sering menimbulkan masalah serius dalam budidaya. Keberadaan Vibrio harveyi dalam jumlah >104 sel/ml dapat menyebabkan kematian massal dalam waktu yang relatif singkat. Gambar 5. Bentuk sel bakteri Vibrio harveyi

27 13 Salah satu spesies dalam kelompok ini yang paling banyak menyebabkan penyakit dan kematian pada budidaya krustasea adalah Vibrio harveyi. Bakteri ini merupakan penyebab penyakit kunang-kunang atau penyakit berpendar, karena krustasea yang terinfeksi akan terlihat terang dalam keadaan gelap (malam hari). Bakteri ini merupakan penyebab utama terhadap tingginya tingkat kematian pada larva krustasea. Vibrio harveyi adalah spesies bakteri penyebab penyakit kunang-kunang (luminescent vibriosis) pada larva udang windu (Penaeus monodon Fabr). Udang windu pada fase zoea paling rentan terhadap serangan bakteri V. harveyi. Selama ini antibakteria sintetis banyak digunakan dalam aquaculture seperti kloramfenikol dan Oxitetrasiklin untuk menghambat atau membunuh bakteri patogen pada udang windu. F. Parameter Lingkungan 1. Kekeruhan Kekeruhan adalah suatu ukuran biasan cahaya di dalam air yang disebabkan oleh adanya partikel koloid dan suspensi dari suatu polutan yang terkandung dalam air. Kekeruhan disebabkan oleh adanya partikel-partikel kecil dan koloid, tanah liat, sisa tanaman dan sebagainya. Kekeruhan air juga disebabkan oleh adanya padatan tarsuspensi seperti lumpur, zat organik, plankton dan organisme kecil lainnya (Effendi, 2003). 2. Nitrat Nitrat adalah bentuk utama nitrogen di perairan alami. Nitrat sangat mudah larut dalam air dan bersifat stabil. Senyawa ini dihasilkan dari proses oksidasi sempurna senyawa nitrogen di perairan. Nitrifikasi yang merupakan proses oksidasi amonia menjadi nitrit dan nitrat adalah proses yang penting dalam siklus nitrogen. Nitrat dapat digunakan untuk mengelompokan tingkat

28 14 kesuburan perairan. Perairan oligtrofik memiliki kadar nitrat antara 0 5 mg/l, perairan mesotrofik memiliki kadar nitrat antara 1 5 mg/l, dan perairan eutrofik memiliki kadar nitrat yang berkisar antara 5 50 mg/l ( Effendi, 2003). 3. BOT Bahan Organik Total menggambarkan jumlah bahan organik suatu perairan yang terdiri dari bahan organik terlarut, bahan organik tersuspensi dan koloid. Bahan organik total mengandung nitrat, fosfat, karbon, amonia dan beberapa mineral yang merupakan nutrien bagi pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba. BOT dapat dikelompokkan ke dalam nutrisi auksotrofik atau membantu pertumbuhan, dan antibiotik atau menghambat pertumbuhan. Bahan organik semacam itu berasal dari perombakan organisme oleh (proses otolisis) atau sisa pencernaan organisme hidup. Jumlah BOT diperkirakan diwakili sebesar 1,2 hingga 2,0 mg C organik dan 0,2 mg N organik per liter, atau 1,5 kg BOT per m 2 luas permukaan. Sedang C partikel sebesar 0,3 dari angka tersebut pada kolom air yang lebih dalam. Plunkett dan Rakestraw dalam Sidharta (2000) menyatakan bahwa BOT dalam laut bervariasi dari 1,41-2,82 mg C organik per liter dengan nilai minimum antara kedalaman 500 dan 750m. G. Uji Patogenitas Patogenisitas atau toksisitas didefinisikan sebagai kemampuan suatu organisme untuk menghasilkan toksin. Uji toksisitas dengan menggunakan naupilus brine srhrimp Artemia salina, dianggap dapat mewakili dampak bakteri terhadap keberlangsungan organisme udang pada fase larva (Gomes-Gil dan Roque dalam Hiola, 2012). Metode brine srhrimp lethality test (BSLT) dengan menggunakan Artemia salina merupakan salah satu metode pengujian toksisitas akut (Zainuddin, 2010). Parameter yang digunakan untuk menunjukkan adanya

29 15 aktivitas biologi suatu senyawa terhadap Artemia salina adalah kematian sebanyak 50% (LC 50 ). Stadia larva Artemia salina yang paling umum digunakan adalah naupilus berumur jam setelah menetas. Konsentrasi letal untuk kematian 50% populasi naupli 24 jam perlakuan (LC 50 ) dapat diartikan sebagai ukuran toksisitas atau patogenitas suatu bahan. Uji BSLT mudah dilakukan, cepat, biayanya murah, dapat dilakukan di dalam laboratorium, dan memiliki tingkat kepercayaan tinggi (Zainuddin, 2010).

30 16 III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret hingga Juli Pengambilan sampel spons dilakukan di Pulau Polewali yang termasuk dalam zona 1 kepulauan spermonde dan Pulau Sarappolompo yang termasuk zona 2 dari Kepulauan Spermonde, Sulawesi Selatan. Isolasi bakteri, Uji patogenisitas, uji antagonis, dan uji aktivitas antibakteri dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Laut Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan (FIKP). Kultur murni bakteri uji diperoleh dari stok bakteri yang ada di laboratorium Mikrobiologi laut yang telah diremajakan. Gambar 6.Peta Lokasi Pengambilan Sampel Spons di kab. Pangkep

31 17 B. Alat dan Bahan 1. Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah: Tabel 1. Alat yang digunakan dalam penelitian No Alat Kegunaan 1. Global Positioning System untuk menentukan titik koordinat (GPS) pengambilan sampel, 2. SCUBA alat bantu menyelam untuk pengambilan sampel, 3. Cool box untuk menyimpan sampel yang telah diambil 4. Inkubator Tempat menumbuhkan bakteri dengan suhu tertentu 5. Jarum ose untuk mengambil isolat bakteri, 6. Botol sampel untuk menyimpan sampel spons 7. Cawan petri untuk menumbuhkan bakteri isolat 8. Tabung reaksi untuk wadah mereaksikan dua atau lebih larutan/bahan kimia 9. Mikropipet untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil 10. Autoklaf untuk sterilisasi alat dan bahan 11. Timbangan analitik untuk mengukur berat sampel 12. Oven untuk sterilisasi kering 13. Gelas ukur untuk mengukur larutan yang akan digunakan 14. Tabung eppendorf untuk menyimpan sampel 15. Sentrifus untuk memisahkan supernatan dengan metabolit 16. Refrigerator untuk menyimpan sampel agar tetap awet 17. Gelas objek untuk fiksasi bakteri 18. Mikroskop untuk melihat sampel bakteri yang berukuran kecil 19. Scapel steril untuk memotong sampel spons 20. Vortex untuk menghomogenkan larutan 21. Shaker incubator untuk menghomogenkan larutan dan diinkubasi 22. Hotplate with magnetic stirrer ntuk menghomogenkan larutan dengan pengadukan 23. Erlenmeyer 250 ml untuk proses titrasi dan penampungan larutan 24. Jangka sorong untuk mengukur jarak daya hambat bakteri 25. Laminary air flow untuk pengerjaan bakteri secara aseptis

32 18 2. Bahan Sedangkan Bahan yang digunakan adalah Spons, TSA (Tryptic Soy Agar) dan TSB (Tryptic Soy Broth) sebagai medium untuk menumbuhkan bakteri, BA (blood Agar), isolat bakteri patogen uji, air laut steril, paper disc, alkohol 70%, aquades, NaCl, kapas, kertas label, tisu, aluminium foil, kertas saring, kloramfenikol dan nistatin sebagai kontrol positif pada uji aktivitas antibakteri, kristal violet, lugol iodine, etanol 95% dan sapranin untuk pewarnaan Gram pada bakteri simbion, dan larva Artemia sebagai hewan uji pada uji patogenitas dengan metode BSLT. C. Prosedur Penelitian Prosedur penelitian untuk penelitian ini terdiri atas beberapa tahap, yang meliputi : 1. Pengambilan Sampel Spons Pengambilan sampel spons dilakukan dengan SCUBA dengan kedalaman ± m. Pengambilan sampel ini dilakukan secara purposif, yaitu dengan menyusuri dasar laut. Spons diambil dengan dipotong menggunakan pisau kemudian dimasukkan dalam kantong sampel. Setelah itu dilakukan dokumentasi pengambilan sampel. Spons kemudian dicuci dengan air laut steril dan dimasukkan ke dalam botol sampel plastik yang telah diisi dengan air laut steril dan gliserol 30%, kemudian disimpan dalam cool box berisi es batu untuk dianalisis selanjutnya di laboratorium. 2. Sterilisasi Peralatan Semua peralatan yang akan digunakan terlebih dahulu disterilkan dengan cara dicuci dan ditiriskan hingga kering, kemudian untuk bahan gelas dibungkus dengan kertas dan disterilkan dengan sterilisasi kering menggunakan oven pada suhu 180 o C selama 2 jam. Untuk alat yang tidak tahan panas dan

33 19 medium disterilkan dengan sterilisasi basah menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 2 atm selama 15 menit (Sidharta, 2000). 3. Pembuatan dan Sterilisasi Media 1. TSA (Tryptic Soy Agar) Komposisi media TSA per liter akuades terdiri dari 15 g tripton, 5 g soy pepton, 5 g NaCl dan 15 g agar. Cara membuatnya yaitu dengan melarutkan 4 g TSA dalam 100 ml akuades kemudian dipanaskan di atas hot plate with magnetic stirrer. Setelah mendidih, media di sterilkan di dalam autoklaf tekanan 2 atm pada suhu 121 o C selama 15 menit. Media kemudian dituang ke dalam cawan petri untuk digunakan. 2. TSB (Tryptic Soy Broth) Komposisi media TSB per liter akuades terdiri dari 17 g tripton, 3 g soy pepton, 2,5 g dektrosa, 5 g NaCl dan 2,5 g K2HPO4. Cara membuatnya yaitu dengan menimbang 3 g TSB dalam 100 ml akuades kemudian dipanaskan di atas hot plate with magnetic stirrer. Setelah mendidih, media di sterilkan di dalam autoklaf tekanan 2 atm pada suhu 121 o C selama 15 menit. Media kemudian dituang ke dalam tabung reaksi untuk digunakan. 3. NaCl Komposisi larutan NaCl per 100 mililiter akuades terdiri dari 0,9 g NaCl dan Akuades 100 ml. Cara membuatnya yaitu dengan menimbang 0,9 g NaCl dalam 100 ml akuades kemudian dipanaskan di atas hot plate with magnetic stirrer. Setelah mendidih, media disterilkan di dalam autoklaf tekanan 2 atm pada suhu 121 o C selama 15 menit. 4. Isolasi Bakteri Simbion Spons Sampel spons dipotong kecil ukuran 2x2 cm menggunakan scalpel steril. Sampel yang telah dipotong kecil dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi

34 20 air laut steril 2 ml kemudian divorteks. Pencucian ini diulang sebanyak 2 kali untuk menghilangkan partikel-partikel yang menempel. Selanjutnya spons digerus dengan menggunakan mortar dalam laminary air flow. Setelah hancur diambil 1 gram spons ditambahkan 9 ml air laut steril, kemudian dilakukan pengenceran hingga Pengenceran dilakukan dengan cara mengambil 1 ml larutan stok lalu dimasukkan ke dalam tabung berisi air laut steril. Kemudian pengenceran 10-1 diambil 1 ml menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kedua yang berisi 9 ml air laut steril. Metode yang sama dilakukan hingga pengenceran Berikut ini adalah skema kerja untuk isolasi bakteri simbion spons

35 21 Petrosia sp. dan Spheciousspongia vagabunda Dipotong 2x2 cm secara aseptik - Divortek - Digerus - Diencerkan hingga 10-6 Medium TSA Inkubasi selama 24 jam pada 0 Isolat Medium TSA Dikultur Isolat murni Gambar 7. Skema kerja isolasi bakteri Sampel yang akan diinokulasi berasal dari pengenceran 10-1 hingga 10-6 dengan cara mengambil masing-masing 1 ml sampel diinokulasikan ke dalam masing-masing cawan petri yang telah diisi dengan 15 hingga 20 ml medium TSA. Cawan yang telah berisi inokulum dihomogenkan dengan gerakan memutar, setelah rata diinkubasi pada suhu 30 o C selama 24 jam. Setelah itu koloni yang didapat diamati morfologi dan warnanya. Koloni yang berbeda kemudian dipindahkan ke dalam cawan petri berisi TSA untuk dimurnikan.

36 22 Kemudian setelah bakteri tersebut murni dikultur lagi dalam agar miring sebagai isolat bakteri simbion yang akan digunakan untuk Uji Antagonis (Gambar 7). 5. Uji Antagonis Terhadap Bakteri Patogen Uji antagonis dilakukan untuk melihat kemampuan kandidat bakteri simbion terhadap bakteri uji. Caranya dengan menghomogenkan bakteri uji dengan NaCl 3 ml dengan menggunakan vorteks untuk dijadikan larutan stok bakteri uji. Kemudian larutan stok tersebut diambil 200 l menggunakan mikropipet diteteskan ke dalam toples yang berisi TSA sebanyak 20 ml. Setelah itu TSA yang telah diteteskan bakteri uji tersebut dipindahkan ke cawan petri dan ditunggu hingga memadat. Setelah memadat cawan dibagi menjadi 3 area untuk menggores bakteri simbion. Cawan yang telah digores dimasukkan ke dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 30 0 C. Hasil positif ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan bakteri selain pada goresannya. Medium yang digunakan untuk uji antagonis ialah TSA (Zainuddin, unpublished). 6. Daya Toksik Isolat Bakteri Simbion Spons (Patogenitas) Daya toksik (toksisitas) dilakukan dengan pengujian brine shrimp lethality test (BSLT) menggunakan Artemia salina dan pengujian agar darah (Blood Agar) yang didapatkan dari Laboratorium Besar Kesehatan Makassar. a. Uji BSLT (brine shrimp lethality test) Uji patogenisitas dilakukan dengan metode brine shrimp lethality test (BSLT) menggunakan larva Artemia salina pada fase nauplius yang aktif, yang telah berumur 48 jam digunakan sebagai hewan uji dalam penelitian pemantauan aktivitas sitotoksik senyawa bioaktif spons (Zainuddin dkk., 2010). Untuk penyiapan larva Artemia salina yaitu 0,5 g 1 g telur Artemia salina direndam dengan air selama menit, telur yang ada di dasar wadah diambil kemudian ditetaskan dalam wadah yang berisi air laut dibawah cahaya

37 23 lampu dan dilengkapi aerator. Telur Artemia salina akan menetas dan menjadi larva setelah 24 jam (Zainuddin dkk., 2010). Pembuatan larutan uji dengan cara memasukkan hasil kultur bakteri simbion ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml medium TSB. Selanjutnya diinkubasi di dalam shaker incubator dengan temperatur 30 o C selama 72 jam. Setelah itu disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit untuk memisahkan residu dan supernatan. Setelah itu diambil 0,1 ml supernatan dan dimasukkan ke tabung eppendorf yang berisi air laut steril 0,9 ml selanjutnya divorteks. Kemudian diambil 500 l dimasukkan dalam vial berisi 4500 l air laut sebagai pengenceran 1000 ppm. Dari pengenceran 1000 ppm diambil 500 l dimasukkan dalam vial berisi 4000 l sebagai pengenceran 100 ppm begitu selanjutnya untuk pengenceran 100 ppm dan 1 ppm. Secara ringkas diagram alir proses uji patogenisitas disajikan pada diagram alir sebagai berikut:

38 24 Isolat Bakteri Simbion Hasil Kultur Dikultur dengan suhu 30 o C selama 72 Supernatan Disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit Dimasukkan dalam botol vial yang telah berisi air laut dengan konsentrasi: 1000 ppm, 100 ppm, 10 ppm dan 1 ppm 10 ekor Larva Artemia salina dimasukkan dalamvial Biarkan selama 24 jam Hitung jumlah artemia yang mati Gambar 8. Skema kerja Metode Uji Patogenisitas Sebagai larutan kontrol adalah air laut steril. Setiap perlakuan serta kontrol dibuat dua kali ulangan. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah Artemia salina yang mati pada tiap konsentrasi. Penentuan harga LC 50 (ppm) dilakukan dengan menggunakan analisis probit dan persamaan regresi (Triyulianti, 2009) b. Uji Patogenitas dengan Metode Blood Agar Uji patogenisitas dengan menggunakan agar darah dilakukan dengan menggores isolat bakteri simbion diatas media agar darah yang telah memadat setelah itu diinkubasi dengan suhu 37 o C selama 24 jam. Setelah itu diamati bentuk hemolisis yang terbentuk. Terbentuknya zona bening menunjukkan bahwa isolat mampu melisiskan darah. Proses lisis sempurna terlihat dari zona

39 25 yang benar-benar jernih ( -hemolisis), proses hemolisis tidak sempurna memperlihatkan media berwarna kehijauan ( -hemolisis). Proses lisis yang tidak nyata menyebabkan tidak terjadi perubahan warna media ( - hemolisis) (Lay dalam Suryanto, 2007) 7. Pengujian Aktivitas Antibakteri Dengan Metode Difusi Agar Uji aktivitas antibakteri ini dilakukan dengan metode difusi agar dengan merujuk pada Zainuddin (2006). Pengujian ini dilakukan dengan menginokulasi supernatan hasil sentrifus isolat bakteri simbion untuk menentukan ada atau tidaknya antibakteri. Bakteri patogen yang digunakan adalah bakteri patogen manusia Staphylococcus aureus untuk bakteri (Gram-positif), Escherichia coli (Gramnegatif) sedangkan bakteri patogen pada organisme budidaya yaitu Aeromonas hydrophilla (bakteri air tawar) dan Vibrio harveyi (bakteri air laut) Berikut ini merupakan skema kerja dari pengujian aktivitas antibakteri Isolat bakteri dari spons Spons Petrosia sp. dan Spheciousspongia vagabunda Dikultur pada media TSB selama 72 jam pada 30 o C Larutan kultur bakteri Disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit Supernatan Biakan murni bakteri patogen Staphylococcus aureus, E. coli, Aeromo hydrophilla, dan Vibrio harveyi - Diinokulasikan 1 ose pada med - Diinkubasi selama 24 jam pada Isolat bakteri yang telah diremajakan Suspensi bakteri - Diambil 200 l dan dituang dalam dihomogenkan - Diinkubasi pada suhu 37 o selam Di analisis dengan one way anova spss Diameter zona hambat Gambar 9. Skema kerja untuk pengujian aktivitas antibakteri

40 26 Bakteri patogen uji yang telah diremajakan dimasukkan dalam larutan NaCl dengan konsentrasi 0,9 dan diambil sebanyak 200 µl lalu dimasukkan kedalam botol yang berisi 20 ml medium TSA, diaduk hingga homogen kemudian dituang kedalam cawan petri dan dibiarkan hingga memadat. Supernatan yang diperoleh hasil sentrifus diteteskan pada paper disc sebanyak 50 l lalu dibiarkan sampai kering. Setelah kering, paper disc diletakkan pada medium secara aseptis setelah itu dibiarkan pada suhu ruangan selama 2 jam kemudian diinkubasi dengan suhu 30 o C selama 24 jam (Gambar 9). Pengujian aktivitas antibakteri ini dilakukan dengan tiga kali ulangan (triplo) (Zainuddin, 2006). 8. Pengujian Gram Bakteri Isolat Simbion Spons Pewarnaan gram dilakukan dengan membuat olesan tipis suspensi dari isolat bakteri berumur 24 jam pada gelas objek yang bersih, kemudian keringanginkan. Setelah kering, difiksasi dengan cara melewatkan bagian bawah gelas objek diatas api bunsen. Selanjutnya hapusan bakteri ditetesi dengan larutan kristal violet selama 1 menit. Dibilas dengan air kran. Kemudian ditetesi dengan larutan iodine dan dibiarkan selama 1 menit. Dibilas dengan air kran. Membilas dengan alkohol 96% selama 20 detik. Dibilas dengan air kran. Ditetesi dengan safranin selama 45 detik. Kemudian dibilas dengan air kran, diletakkan di atas kertas serap. Mengamati hasil pewarnaan di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000 x untuk memperjelas morfologi sel bakteri ditetesi dengan minyak imersi di atas cover glass. Sel bakteri Gram-positif akan berwarna ungu hingga biru, sedangkan bakteri Gram-negatif akan berwarna merah (Cappucino dan Sherman, 1987).

41 27 D. Analisis Data Data hasil isolasi, dan uji antagoni dianalisis secara deskriptif dengan bantuan tabel dan gambar, data Uji Patogenisitas diuji dengan menggunakan analisis Probit dan persamaan regresi kemudian dianalisis secara deskriptif. Sedangkan untuk mengetahui perbedaan kemampuan aktivitas antibakteri isolat bakteri simbion terhadap bakteri uji dilakukan analisis sidik ragam one-way ANOVA, dan jika terdapat perbedaan dilakukan uji lanjut dengan analisis Tukey. Analisis tersebut dengan menggunakan alat bantu perangkat lunak SPSS versi 17.

42 28 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Isolat Bakteri Simbion Spons 1. Morfologi koloni isolat bakteri simbion spons Morfologi bakteri diamati secara makroskopis dengan mengacu pada Cappucino dan Sherman (1986). Morfologi koloni simbion spons Petrosia sp. dan Spheciousspongia vagabunda dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Morfologi koloni bakteri simbion spons yang berasal dari Pulau Polewali dan Pulau Sarappolompo Lokasi Pulau Polewali Pulau sarappolompo Kode Morfologi Koloni isolat Bentuk Tepi Elevasi warna PW-1 Tidak teratur Berombak Datar Putih susu PW-2 Bulat Utuh Cembung Kuning PW-3 Bulat Utuh Cembung Putih Susu PW-4 Bulat Berombak Naik Putih Susu PW-5 Bulat Utuh Cembung Kuning PW-6 Bulat Utuh Datar Krem PW-7 Bulat Berombak Membukit Putih Susu PW-8 Bulat Utuh Cembung Krem PW-9 Bulat Utuh Cembung Kuning PW-10 Bulat Utuh Cembung Putih Susu PW-11 Bulat Utuh Cembung Kuning Muda PW-12 Tidak teratur Berombak Datar Krem PW-13 Bulat Utuh Cembung Krem PW-14 berserabut Berfilamen Datar Putih Susu PW-15 Bulat Utuh Cembung Krem SL-1 Bulat Utuh Cembung Kuning SL-2 Bulat Berombak Cembung Putih Susu SL-3 Bulat Berombak Naik Putih Susu

43 29 Tabel 1 diatas memperlihatkan bahwa bentuk yang dominan pada koloni bakteri ialah bulat danwarna yang dominan ialah warna putih susu. Setiap koloni bakteri yang tumbuh dipisahkan berdasarkan warna, ukuran dan bentuk koloni, serta dimurnikan dengan menggunakan media yang sama. Berdasarkan hasil pengamatan morfologi koloni bakteri simbion spons Petrosia sp. didapatkan 15 isolat dari Pulau Polewali dan 3 isolat dari spons Spheciousspongia vagabunda asal Pulau Sarappolompo. Morfologi koloni masing-masing isolat disajikan pada Tabel 2 dan Gambar 11 a. PW 10-3 PW 10-4 PW 10-6 b. SL 10-3 SL 10-4 SL 10-6 Gambar 10.Koloni bakteri simbion spons pada medium TSA a. berasal dari Pulau Polewali; b.bakteri berasal dari Pulau Sarappolompo Tabel 2 diatas menunjukkan bahwa jumlah isolat dari spons Petrosia sp. Lebih banyak dibandingkan dengan spons Spheciousspongia vagabunda. Hal ini kemungkinan dapat disebabkan karena perbedaan jenis spons.