ISOLASI PEPTIDA ANTI HIPERTENSI DARI PROTEIN SUSU. Isolation of Anti Hypertensive Peptides from Milk Protein (Abubakar)

Transkripsi

1 ISOLASI PEPTIDA ANTI HIPERTENSI DARI PROTEIN SUSU (Isolation of Anti Hypertensive Peptides from Milk Protein) A. Abubakar Jurusan Peternakan Fakultas Pertanian Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh ABSTRAK Protein whey dicerna dengan 7 jenis enzim protease pada temperatur 37 o C ( tripsin, protease-k, aktinase- E, termolisin dan papain) atau pada temperatur 25 o C (pepsin dan kimotripsin) selama 24 jam. Sampel tersebut selanjutnya dilakukan pengujian terhadap aktivitas penghambat enzim pengubah angiotensin dan pengukuran tekanan darah sistolik pada tikus percobaan ( spontaneously hypertensive rats, SHR) setelah pemberian sampel secara gastrik inkubasi. Penurunan tekanan darah sistolik yang sangat tajam (-55 mmhg) terdapat pada sampel protein whey yang dilakukan pencernaan dengan enzim proteinase-k. Hasil analisis dengan menggunakan kromatografi, terdapat 6 jenis peptida yang mempunyai kemampuan anti hipertensi. Urutan asam amino dari masing-masing peptida tersebut adalah sebagai berikut : Val-Tyr-Pro- Phe-Pro-Gly (b-casein:f59-64), Gly-Lys-Pro (b 2 -microglobulin:f18-20), Ile-Pro-Ala (b-lactoglobulin:f78-80), Phe- Pro (Serum albumin:f , b-casein:f62-63, f: , f ), Val-Tyr-pro (b-casein:f59-61), dan Thr-Pro- Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro (b-casein:f80-90). Selanjutnya ke 6 jenis peptida tersebut diberikan kepada tikus SHR. Dari hasil pengujian tersebut ternyata tripeptida Ile-Pro-Ala menunjukkan hasil yang sangat kuat mempunyai kemampuan anti hipertensi (-31 mmhg). Kata kunci : peptida anti hipertensi, protein whey, isolasi ABSTRACT Whey protein was digested with 7 types of proteases at 37 o C (trypsin, proteinase-k, actinase-e, thermolysin and papain) or at 25 o C (pepsin and chymotrypsin) for 24 hr. Digested samples then were assayed for angiotensin converting enzyme inhibitory activity and systolic blood pressure (SBP) in spontaneously hypertensive rats (SHR) after gastric incubation. The strongest depressive effect on SBP (-55 mmhg) was observed at 6 hr after gastric incubation of whey protein digested by proteinase-k. Finally, six peptides were chromatographically isolated from the proteinase-k digesta by a combination of hydrophobic reverse phase high performance liquid chromatography and gel filtration. The amino acid sequences and their origins were clarified as follows: Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly (b-casein:f59-64), Gly-Lys-Pro (b 2 -microglobulin:f18-20), Ile-Pro- Ala (b-lactoglobulin:f78-80), Phe-Pro (Serum albumin:f , b-casein:f62-63, f: , f ), Val-Tyrpro (b-casein:f59-61), and Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro (b-casein:f80-90). Chemical synthesis of the above six peptides confirmed that all peptides, except an undecapeptide, have antihypertensive activity in SHR. The synthetic tripeptide Ile-Pro-Ala, originating from b-lactoglobulin, showed the strongest antihypertensive activity (-31 mmhg). Keywords : anti hypertensive peptides, whey protein, isolation Isolation of Anti Hypertensive Peptides from Milk Protein (Abubakar) 121

2 PENDAHULUAN Suatu penelitian terapan dilakukan untuk mengisolasi peptida anti hipertensi yang terkandung dalam protein susu. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui struktur kimia spesifik dari masingmasing peptida tersebut, sehingga akan mempermudah dalam membuat formulasi suatu produk dalam penerapannya kepada konsumen. Berbagai penelitian sudah dilakukan untuk mencari komponen bioaktif yang terkandung dalam berbagai bahan pangan, diantaranya dari ikan (Astawan et al., 1995), kasein manusia (Kohmura et al., 1990) dan sumber bahan pangan lainnya (Abubakar et al., 1996; Abubakar et al., 1996; Masuda et al., 1996; Meisel et al., 1997; Takahashi et al., 1997; Yamamoto, 1997). Namun demikian sampai penelitian ini dilakukan, penemuan peptida anti hipertensi yang diperoleh dari protein susu khususnya protein whey masih sangat terbatas informasinya. Protein whey adalah produk sampingan dari industri pembuatan keju, mudah didapat dan murah harganya. Didukung pula oleh tersedianya peralatan yang memadai dan metoda yang tidak begitu rumit dalam melakukan percobaan. Bahkan dipandang dari aspek kepentingan Nasional, penelitian ini akan membawa manfaat yang sangat besar bagi kemuslihatan ummat manusia. Berbagai penelitian pendahuluan telah dilakukan untuk membuktikan adanya peptida anti hipertensi yang terkandung dalam protein whey, dan sampai pada tahap penelitian ini kami telah dapat mengekstraksi sejumlah peptida yang berpengaruh terhadap penurunan tekanan darah tinggi. MATERI DAN METODE Tepung whey didapatkan dari Snow Brand Milk Products Co., Ltd. (Tokyo, Jepang). Tujuh jenis enzim pencernaan yaitu pepsin (EC ), tripsin (EC ), kimotripsin (EC ), proteinase-k (EC ), papain (EC ), termolisin (EC ) dan aktinase-e diperoleh dari Wako Pure Chemical Co., Ltd (Osaka, Jepang). Enzim pengubah angiotensin (EC ) dan substrat hippurylhistidyl-leucine (HHL) yang dibeli pada Sigma Chemical Co., Ltd. (St. Louis, USA). Enam jenis peptida sintetis yang diperoleh dari Jerman via Sawaday Technology (Tokyo, Jepang). Tiga puluh ekor tikus SHR (Spontaneously Hypertensive Rats), berumur 12 minggu dengan kisaran berat badan antara g diperoleh dari Charles River Jepang Inc. (Kyoto, Jepang). Pencernaan Protein Whey dengan Menggunakan 7 Jenis Enzim Tujuh jenis enzim pencernaan (pepsin, tripsin, kimotripsin, proteinase-k, aktinase-e, termolisin dan papain) digunakan untuk mencernakan protein whey dengan kondisi optimal terhadap bufer, ph dan suhu (Tabel 1). Protein whey (10 mg) dilarutkan kedalam masing-masing bufer enzim (10 ml) dan ditambahkan pepsin dan kimotripsin dalam perbandingan protein dan enzim adalah 100 : 5, selanjutnya diinkubasi pada suhu 25 o C selama 24 jam. Pencernaannya dengan menggunakan 5 jenis enzim lainnya dilakukan pada suhu 37 o C selama 24 jam. Setelah inkubasi, masingmasing sampel segera dipanaskan pada suhu 98 o C Tabel 1. Kondisi Optimal Bufer, ph dan Temperatur terhadap 7 Jenis Enzim Pencernaan Enzim Bufer ph Temperatur ( o C) Pepsin 0,05N HCL 2,0 25 Tripsin 0,02M Tris-HCL* 8,0 37 Kimotripsin 0,02M CH 3 COONH 4 8,0 25 Proteinase-K 0,02M Tris-HCl 7,5 25 Aktinase-E 0,02M Tris-HCl* 8,0 37 Termolisin 0,02M Tris-HCl* 8,0 37 Papain 0,02M Sodiumphosphate 7,5 37 HCL:asam khlorida; Tris: trishydroxymethyl amino methane; CH 3COONH 4: amonium asetat; *mengandung 10mM of CaCl J.Indon.Trop.Anim.Agric.29 (3) September 2004

3 Ilustrasi 1. Kemampuan Anti hipertensi Protein Whey yang telah Dicernakan dengan Enzim Proteinase-K dan Fraksi yang telah Diperlakukan dengan Resin dan Metanol. A (Pencernaan protein whey dengan proteinase-k); B (10%); C (20%); D (30%); E (40%); F (50%); G (60%); H (70%); I (80%); J (90%) metanol. Angka di atas diukur setelah 6 jam pemberian sampel dengan dosis 8 mg/kg berat badan SHR. selama 10 menit untuk menghentikan reaksi enzimatis. Pengujian Aktivitas Penghambat Enzim Pengubah Angiotensin (in vitro) Pengujian aktivitas penghambat enzim pengubah angiotensin dilakukan menurut metoda Yamamoto (1997; Tabel 2). Larutan sampel (30ml) ditambahkan dengan 20ml substrat HHL dan 2ml larutan enzim pengubah angiotensin. Campuran larutan sampel tersebut diinkubasi pada suhu 37 o C selama 60 menit, dan reaksi dihentikan dengan menambahkan 50ml larutan 0,5N HCl. Kandungan asam hippuric yang dibebaskan dari HHL oleh reaksi enzim pengubah angiotensin diukur dengan menggunakan Spektrofotometrik pada panjang gelombang 228 nm. Konsentrasi penghambat enzim pengubah angiotensin yang dibutuhkan untuk menghambat 50% aktivitas enzim pengubah Tabel 2. Metoda Pengukuran Aktivitas Penghambat Enzim Pengubah Angiotensin R e a g e n As 1 Ac 2 Ab 3 Larutan sampel 30 Air destilasi Larutan substrat Larutan enzim pengubah angiotensin Larutan stop reaksi* 50 Inkubasi (37 o C selama 1 jam) Larutan stop reaksi Total volume absorban sampel; 2 absorban kontrol; 3 absorban blank; *0,5N HCl. Isolation of Anti Hypertensive Peptides from Milk Protein (Abubakar) 123

4 Ilustrasi 2. Fraksinasi Lanjutan Fraksi E dalam Ilustrasi 1. dengan Menggunakan Persentase Metanol dan Pengujian Pengaruh Anti hipertensi pada SHR. 1 (fraksi E dalam Ilustrasi 1, 40% metanol); 2 (E-40.30%); 3 (E %); 4 (E-40.36%); 5 (E-40.39%); 6 (E-40.42%) metanol. Kondisi lain sama seperti yang terdapat pada Ilustrasi 1. angiotensin, didefinisikan sebagai nilai IC 50 ( 50% inhibitory concentration ). Pengujian Penurunan Tekanan Darah pada Tikus (in vivo) 'Spontaneuously hypertensive rats' (SHR) dimasukkan kedalam sangkar dan ditempatkan dalam ruangan penelitian dengan 12 jam siklus cahaya terang dan gelap. Suhu dan kelembaban ruangan dikontrol berturut-turut pada 24 ± 1 o C dan 60 ± 3%. SHR diberi makanan standar dan air minum secara tak terbatas. Masing-masing sampel disuntik langsung kedalam lambung dengan dosis 8 mg/kg berat badan SHR. Pengukuran tekanan darah SHR diukur pada 3, 6, 9, 12 dan 24 jam setelah dilakukan penyuntikan sampel. Preparasi Sampel Peptida Anti hipertensi Protein whey (10g) dilarutkan ke dalam 1L bufer Tris-HCl (ph 7,5), selanjutnya diinkubasi dengan enzim proteinase-k pada suhu 37 o C selama 24 jam. Setelah 24 jam inkubasi, larutan sampel tersebut segera dipanaskan pada suhu 98 o C selama 10 menit untuk menghentikan reaksi enzimatik. Larutan tersebut disentrifusi pada kecepatan rpm selama 30 menit, supernatan dipisahkan melalui Tabel 3. Seleksi Sampel yang Berpengaruh terhadap Aktifitas Penghambat Enzim Pengubah Angiotensin dan Aktivitas Anti hipertensi setelah Dilakukan Pencernaan dengan Enzim Sampel Aktifitas enghambat enzim pengubah angiotensin (%) Penurunan tekanan darah sistolik (mmhg) Protein whey (kontrol) 0,0-38 Pepsin 83,7-47 Tripsin 56,7-51* Kimotripsin 76,0-40 Proteinase-K 95,7-55** Aktinase-E 55,7-55** Termolisin 98,6-42 Papain 86,5-47 *P < 0,05; **P < 0, J.Indon.Trop.Anim.Agric.29 (3) September 2004

5 Ilustrasi 3. Penampilan Kromatogram Peptida Anti hipertensi dari Fraksi nomor 5 dengan Menggunakan Kromatografi Cairan. Kolom: Superiorex ODS (4.6 x 150 mm); Reagen A (0.05% TFA dalam 10% acetonitrile) dan reagen B (0.05% TFA dalam 60% acetonitrile); Suhu (40 o C); Deteksi (220 nm). penyaringan dengan menggunakan kertas saring No.5C. Supernatan yang diperoleh, diaduk dan dikocok dengan menggunakan resin kromatografi LiChroprep RP-18 agar peptida yang terkandung dalam supernatan tersebut akan terikat dengan resin. Resin yang mengandung peptida tersebut sedikit demi sedikit dilepaskan kembali dengan menggunakan pengenceran metanol dari 0-90% dengan interval 10%. Sepuluh jenis sampel yang diperoleh dari perlakuan di atas, siap untuk diberikan kepada SHR, dan hasilnya tercantum pada Ilustrasi 1. Selanjutnya fraksi E pada Ilustrasi 1 yang diseleksi sebagai sampel utama untuk tahapan penelitian selanjutnya akan diperlakukan dengan resin kembali seperti yang telah diterangkan sebelumnya, dan kali ini enceran metanol digunakan dari 30% - 42% dengan interval 3%. Masing-masing sampel tersebut (5 sampel) masih diberikan kepada SHR untuk menyelidiki fraksi sampel yang berpengaruh kuat terhadap penurunan tekanan darah pada SHR, dan hasilnya tercantum pada Ilustrasi 2. Isolation of Anti Hypertensive Peptides from Milk Protein (Abubakar) 125

6 Analisis Kimia Kandungan protein sampel ditentukan dengan menggunakan metoda Folin-Lowry (Lowry et al., 1950). Analisis komponen peptida yang ada dalam sampel dengan menggunakan kromatografi cairan (Ilustrasi 3), masing-masing fraksi pada Ilustrasi 3 ditampung, dan kemurnian hasil tampungan tersebut diuji dengan menggunakan kolom yang sama (Ilustrasi 4) dan gel filtrasi. HASIL DAN PEMBAHASAN Seleksi Sampel yang Berpengaruh terhadap Anti hipertensi Delapan jenis sampel yaitu protein whey (kontrol) dan tujuh jenis sampel protein whey yang masing-masing dicernakan oleh enzim pepsin, tripsin, kimotripsin, proteinase-k, aktinase-e, termolisin dan papain, diuji aktivitas penghambat enzim pengubah angiotensin (secara in vitro) dan kemampuan penurunan tekanan darah pada SHR (secara in vivo), hasilnya tercantum pada Tabel 3. Dari Tabel 3 terlihat bahwa protein whey (kontrol) menunjukkan hasil 0% pada pengujian secara in vitro dan pengujian secara in vivo ternyata dapat menurunkan tekanan darah SHR sampai -38 mmhg. Disini terbukti bahwa sampel yang tidak diperlakukan dengan enzim pencernaan dan diberikan langsung kepada SHR, dapat menurunkan tekanan darah SHR. Hal tersebut terjadi karena di lambung SHR terdapat berbagai enzim yang dapat mencerna sendiri sampel yang disuntikkan langsung kedalam lambung, dan dapat menurunkan tekanan darah sampai mencapai -38 mmhg. Sampel lain pada Tabel 3 terlihat bahwa ada sampel yang secara in vitro dapat menunjukkan kemampuan aktifitas penghambat enzim pengubah angiotensin yang tinggi, akan tetapi menunjukkan hasil yang rendah setelah dicobakan secara in vivo. Sebaliknya hasil yang rendah pada percobaan in vitro menunjukkan hasil yang tinggi pada percobaan in vivo. Hanya terdapat satu sampel yang dapat menunjukkan hasil yang tinggi baik pada perlakuan secara in vitro maupun secara in vivo yaitu sampel yang dicernakan dengan menggunakan enzim proteinase-k, yang memiliki aktifitas penghambat enzim pengubah angiotensin sampai mencapai 95,7% dan pengaruh penurunan tekanan darah SHR sampai mencapai -55 mmhg. Oleh karenanya sampel ini digunakan sebagai sampel dasar yang digunakan untuk perlakuan berikutnya. Isolasi Peptida Anti hipertensi Berdasarkan hasil seleksi sampel protein whey yang dicernakan dengan enzim proteinase-k, selanjutnya diperlakukan dengan menggunakan resin LiCroprep RP-18 dan metanol, seperti yang telah dijelaskankan dalam metoda dan hasilnya tercantum pada Ilustrasi 1. Dari hasil perlakuan sampel tersebut diperoleh 10 jenis sampel yaitu A (0%), B (10%), C (20%), D (30%), E (40%), F (50%), G (60%), H (70%), I (80%) dan J (90%) metanol. Masing-masing sampel tersebut diberikan kepada SHR dan pengaruhnya terhadap penurunan tekanan darah diamati setelah 6 jam pemberian sampel dengan dosis 8 mg/kg berat badan SHR. Dari Ilustrasi 1 terlihat bahwa fraksi A (kontrol) adalah protein whey yang dicernakan dengan enzim proteinase-k (pada Tabel 2) dapat menurunkan tekanan darah SHR sebesar 55 mmhg. Selanjutnya diikuti oleh fraksi E (40% metanol) dan B (10% metanol) berturut-turut -54 mmhg dan - 53mmHg. Di lain pihak, sampel lain mempunyai kemampuan yang rendah dibandingkan dengan kedua fraksi sampel E dan B. Fraksi E pada Ilustrasi 1 yang dipilih sebagai sampel seleksi awal yang akan digunakan untuk percobaan berikutnya, selanjutnya diperlakukan lagi dengan menggunakan resin LiCroprep RP-18 dan metanol seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Untuk tahap ini hanya menggunakan persentase metanol yaitu 30%, 33%, 36%, 39% dan 42%, dengan demikian jumlah sampel yang diperoleh sebanyak 5 buah. Untuk melihat kemampuan anti hipertensi dari masing-masing sampel tersebut, maka ke 5 sampel tersebut masih diberikan kepada SHR dan penurunan tekanan darah diukur setelah 6 jam pemberian sampel. Hasil pengujian tersebut dapat dilihat pada Ilustrasi 2. Kelima fraksi sampel yang dimaksud adalah No.2 (30%), No.3 (33%), No.4 (36%), No.5 (39%) dan No.6 (42%) metanol, sedangkan No.1 adalah kontrol (dari fraksi E pada Ilustrasi 1). Dari 126 J.Indon.Trop.Anim.Agric.29 (3) September 2004

7 Tabel 4. Struktur Peptida Anti hipertensi dan Aktifitas Penghambat Enzim Pengubah Angiotensin Sampel Sekuen Original SBP 1 (mmhg) BM 2 (Da) 3 IC 50 (µm) a Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly β-cn:f59-64e -22* 678, b1 Gly-Lys-Pro β 2 -m:f * 300, b2 Ile-Pro-Ala β-lg:f ** 299, c2 Phe-Pro SA:f * 262, d Val-Tyr-Pro β-cnd:f * 377, f Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro- β-cnd:f , Phe-Leu-Gln-Pro 1 Tekanan darah sistolik; 2 Berat molekul; 3 Konsentrasi peptida yang dibutuhkan untuk menghambat 50% aktivitas enzim pengubah angiotensin; β-cn:β-casein; β 2-m:β2-microglobulin; β-lg:β-lactoglobulin; SA: Serum albumin. Ilustrasi 2 terlihat bahwa fraksi No.3 dan No.5 hasilnya hampir tidak berbeda nyata, oleh karenanya untuk tahapan penelitian berikutnya hanya menggunakan fraksi No.5 (39% metanol) dengan kemampuan penurunan darah tinggi sebesar - 46mmHg. Analisis dengan menggunakan kromatografi cairan dari sampel fraksi No.5 pada Ilustrasi 2 dapat dilihat hasil kromatogramnya yang tercantum pada Ilustrasi 3, dimana terdapat 6 fraksi peptida anti hipertensi yaitu fraksi a, b, c, d, e dan f. Masingmasing fraksi peptida tersebut ditampung cairannya melalui kromatografi cairan dan selanjutnya hasil tampungan tersebut diuji kembali kemurniannya untuk tahap pertama dengan menggunakan kolom yang sama. Hasil penampungan dari masing-masing peptida anti hipertensi tersebut dianggap seluruhnya sudah murni, karena terbukti hanya satu pik saja yang muncul dari hasil uji tersebut. Struktur Kimia Peptida Anti hipertensi Sekuen asam amino dari 6 buah peptida anti hipertensi seperti yang tercantum pada Tabel 4 adalah sebagai berikut: a (Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly), b1 (Gly- Lys-Pro), b2 (Ile-Pro-Ala), c2 (Phe-Pro), e (Val-Tyr- Pro) dan f (Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln- Pro). Sebagai usaha akhir untuk mengetahui fraksi diantara 6 peptida di atas yang mempunyai kemampuan tinggi terhadap penurunan tekanan darah, adalah dengan cara memesan peptida sintesis dari Belanda (via Sawaday Technology, Tokyo) dan dilakukan pengujian ulang pada SHR. Hasil pengujian tersebut dapat terlihat pada Tabel 3. Peptida sintesis b2 (Ile-Pro-Ala) dengan berat molekul 299,39 Da dan nilai IC mm, dapat menunjukkan kemampuan yang tinggi terhadap penurunan tekanan darah SHR sampai mencapai angka -31mmHg. Suatu hal yang sangat menarik yang tersaji pada Tabel 3 adalah keenam sampel tersebut mengandung residu Prolin (Pro) dalam rantai peptidanya. Peptida a dan b2, mengandung residu prolin yang terdapat pada posisi tengah rantai peptidanya, sedangkan peptida lainnya terdapat residu prolin pada posisi ujung C-terminal dari rantai peptidanya. Hasil penelitian ini sesuai dengan hasil yang telah ditemukan oleh beberapa peneliti lain diantaranya melaporkan bahwa terdapatnya satu atau beberapa residu prolin dalam rantai peptidanya (10-12). Bahkan Maeno et al. (1996) mengemukakan bahwa apabila dalan rantai peptidanya terdapat residu prolin, akan mempunyai aktifitas anti hipertensi yang lebih baik dibandingkan dengan rantai peptida yang sama sekali tidak mengandung residu prolin. KESIMPULAN Enam jenis peptida anti hipertensi yang telah dapat diisolasi dalam protein whey susu yaitu petida a (Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly), b1 (Gly-Lys-Pro), b2 (Ile- Pro-Ala), c2 (Phe-Pro), d (Val-Tyr-Pro) dan f (Thr- Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro). Keenam peptida anti hipertensi tersebut, setelah diberikan kepada SHR dengan dosis 8mg/kg berat badan, dan tekanan darah diukur setelah 6 jam pemberian sampel, hanya peptida b2 (Ile-Pro-Ala) yang dapat menunjukkan kemampuan yang tinggi terhadap penurunan tekanan darah pada SHR yaitu sampai mencapai-31mmhg. Isolation of Anti Hypertensive Peptides from Milk Protein (Abubakar) 127

8 DAFTAR PUSTAKA Abubakar, A., T. Saito., M.A. Aimar, and T. Itoh New derivation of the inhibitory activity against angiotensin converting enzyme from sweet cheese whey. Tohoku J. Agric. Res. 47 : 1-8. Abubakar, A., T. Saito., T. Itoh., I. Arai, and M.V. Aimar Development of a new type of fermented cheese whey beverage with inhibitory effects against angiotensin converting enzyme. Tohoku J. Agric. Res. 48 : Astawan, M., M. Wahyuni., T. Yasuhara., K. Yamada., T. Todokoro, and A. Maekawa Effects of angiotensin I-converting enzyme inhibitory substances derived from Indonesian driedsalted fish on blood pressure of rats. Biosci. Biotech. Biochem. 59 : Kohmura, M., N. Nio., K. Kubo., Y. Minoshima., E. Munekata and Y. Ariyoshi Inhibition of ACE by synthetic peptide fragments of human k-casein. Agric. Biol. Chem. 54 : Lowry, O.H., N.J. Resebrough., A.L. Farr and R.J. Randall Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 : proteinase from Lactobacillus helveticus CP790. J. Dairy Sci. 79 : Masuda, O., Y. Nakamura and T. Takano Antihypertensive peptides are present in aorta after oral administration of sor milk containing these peptides to spontaneously hypertensive rats. Am. Institute of Nutr. 12 : Meisel, H., A. Goepfert and S. Gunther ACE inhibitory activi- ties in milk products. Milchwissenschaft 52 : Takashashi, M., S. Moriguchi., T. Minami., H. Suganuma., A. Shiota., Y. Takenaka., F. Tani., R. Sasaki and M. Yoshikawa Albutensin A, an ileum-contracting peptide derived from serum albumin, acts through both receptors for complements C3a and C5a. Letters in Peptide Science. 4 : 1-7. Yamamoto. N Antihypertensive peptides derived from food proteins. Biopoly. 43 : Yamamoto, N., A. Akino and T. Takano Antihypertensive effects of the peptides derived from casein by an extracellular proteinase from Lactobacillus helveticus CP790. J. Dairy Sci. 77 : Maeno, M., N. Yamamoto and T. Takano Identification of an antihypertensive peptide from casein hydrolysate produced by a 128 J.Indon.Trop.Anim.Agric.29 (3) September 2004