PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEASE DARI BAKTERI HASIL ISOLASI DARI WHEY TAHU

Transkripsi

1 PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEASE DARI BAKTERI HASIL ISOLASI DARI WHEY TAHU Purification and Characterization of Protease from Protease-producing Bacteria Isolated from Tofu Whey Agustin Krisna Wardani* dan Lia Oriana Nindita Jurusan Teknologi Hasil Pertanian - Fakultas Teknologi Pertanian - Universitas Brawijaya Jl. Veteran - Malang *Penulis Korespondensi: agustinwardani@ub.ac.id ABSTRAK Penelitian ini menggunakan whey tahu sebagai sumber untuk mengisolasi bakteri penghasil protease. Hasil isolasi menunjukkan bahwa dari 30 isolat yang diperoleh, satu isolat yaitu LnA4 menunjukkan aktivitas protease tertinggi sebesar U/mg. Purifikasi menggunakan amonium sulfat dan dialisis menunjukkan peningkatan kemurnian sebesar kali dengan aktivitas spesifik protease sebesar 7.13 U/mg. Aktivitas maksimum protease dicapai pada kondisi 37 o C, ph 7.5 dan pada konsentrasi substrat kasein 0.6%. Nilai K M and V max protease masing-masing sebesar mg/ml dan mg/ml/menit. Hasil zimogram pada SDS-PAGE menunjukkan bahwa protease memiliki berat molekul sebesar kda. Kata kunci: isolasi, purifikasi, karakterisasi, protease, whey tahu ABSTRACT In this study, soybean liquid waste (tofu whey), was used to isolate the protease- producing bacteria. The aim of this research is to purify and characterize the protease isolated from protease producing bacteria. Thirty isolates were obtained from isolation and screening of protease-producing bacteria from tofu whey. One isolate, LnA4, had the highest protease activity (0.123 U/mg). The protease was purified by ammonium sulphate and dialysis resulted an enzyme with specific activity of 7.13 U/mg with purification fold The maximum protease activities for the enzyme was attained at 37 ⁰ C, ph 7.5 and 0.6% of casein concentration. The K M and V max of the enzyme were mg/ml and mg/ml/minute, respectively. The molecular weight of the enzyme was determined as kda on SDS-PAGE and zimogram. Keywords: isolation, purification, characterization, protease, tofu whey PENDAHULUAN Protease adalah salah satu enzim yang memiliki prospek paling baik untuk dikembangkan karena dipandang cukup luas aplikasinya dalam berbagai industri, baik pangan maupun non pangan. Protease merupakan satu dari tiga kelompok enzim terbesar dari industri enzim dan diperkirakan sebesar 60% dari total enzim yang diperjual belikan di seluruh dunia (Rao et al., 1998; Singh et al., 2001; Gupta et al., 2005). Protease adalah enzim yang dapat menghidrolisis protein menjadi senyawasenyawa yang lebih sederhana seperti peptida kecil dan asam amino (Bains, 1998). Industri pengguna protease diantaranya di bidang pangan (sebagai pengempuk daging, penjernih bir, pembuatan keju dan pembuatan cracker dan dibidang non pangan (industri deterjen, industri kulit, industri tekstil, biomedis sampai industri pakan ternak) (Gupta et al., 2002). Mikroorganisme adalah sumber enzim yang paling banyak digunakan dibandingkan hewan dan tanaman. Sebagai sumber enzim, mikroorganisme dianggap lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat dan mudah diatur, dapat tumbuh pada substrat yang murah, dapat diproduksi dalam skala besar dan mutu lebih seragam (Suhartono, 1989). 149

2 Hingga saat ini sebagian besar enzim yang digunakan dalam industri di Indonesia masih diimpor. Keadaan ini tentunya sangat merugikan jika ditinjau secara ekonomi, padahal Indonesia merupakan negara tropis yang kaya akan sumber alam hayati, terutama mikroba penghasil enzim, termasuk protease. Oleh karena itu, penggalian mikroorganisme indigenous penghasil protease perlu dilakukan di Indonesia. Pasar yang luas dan sumber daya alam yang mendukung merupakan peluang yang besar untuk mendapatkan mikroorganisme yang potensial untuk dikembangkan sebagai penghasil enzim. Pada penelitian ini limbah cair tahu (whey tahu) digunakan sebagai sumber untuk mendapatkan isolat penghasil protease (bakteri proteolitik) karena mengandung protein sekitar 1.75% (Enie dan Supriatna, 1993). Selanjutnya dilakukan purifikasi dan karakterisasi enzim protease yang dihasilkan. BAHAN DAN METODE Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel limbah cair tahu yang diambil dari industri tahu rumah tangga di daerah Tunggulwulung Malang. Media yang digunakan untuk isolasi terdiri dari skim milk 2%, pepton 0.5%, yeast ekstrak 0.1%, glukosa 2%, NaCl 0.1%, KH 2 PO %, MgSO 4.7H 2 O 0.01% dan (NH 4 ) 2 SO % (Elsafey dan Raouf, 2004). Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf (Hirayama HL 36 AE), Laminar Air Flow (LAF), vortex (VM-2000), phmeter (ph Electrode PE-01), inkubator (Binder), neraca Mettler (Toledo Denver M-310), spektrofotometer UV- 2100, Mini Protean 3 Cell Elektroforesis (Biorad), shaker waterbath (Memmert), refrigerated centrifuge, mikroskop (Olympus CH 2 O), mikropipet (Socorex), termometer, magnetic stirer, hot plate, refrigerator, dan glassware. Tahap Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahap. tahap pertama adalah isolasi dan identifikasi bakteri yang menghasilkan enzim protease dengan aktivitas protease tertinggi. Tahap kedua adalah isolasi enzim kasar protease dan purifikasi parsial dengan pengendapan menggunakan amonium sulfat, dilanjut proses dialisis. Tahap ketiga adalah karakterisasi ph, suhu, K M serta berat molekul enzim protease menggunakan elektroforesis SDS-PAGE yang selanjutnya dikonfirmasi dengan zimogram (Mehzard et al., 2005). Isolasi Bakteri Penghasil Protease (Rahayu, 1991, dengan modifikasi) Sampel limbah cair tahu diambil dari industri tahu rumah tangga di daerah Tunggulwulung Malang kemudian dilakukan pengkayaan atau enrichment. Hasil dari pengkayaan kemudian dilakukan pengenceran untuk ditumbuhkan pada media produksi protease padat (metode spread) yang mengandung kasein dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Uji positif ditandai dengan adanya zona bening yang terbentuk di sekeliling koloni akibat adanya hidrolisis kasein menjadi nitrogen terlarut. Koloni tunggal yang menghasilkan zona bening kemudian dimurnikan. Setelah didapatkan isolat yang positif menghasilkan protease, dilakukan uji secara kualitatif dan kuantitatif serta karakterisasi bakteri meliputi uji morfologi koloni dan uji biokimia. Produksi enzim (El-safey dan Raouf, 2004) Produksi enzim dilakukan dengan menumbuhkan bakteri ke dalam 45 ml media cair dengan komposisi skim milk 2%, pepton 0.5%, yeast ekstrak 0.1%, glukosa 2%, NaCl 0.1%, KH 2 PO %, MgSO 4.7H 2 O 0.01% dan (NH 4 ) 2 SO % (El-safey dan Raouf, 2004) dan diinkubasi pada suhu 37 C selama jam (akhir fase logaritmik). Kultur starter sebanyak 50 ml dimasukkan dalam 450 ml media produksi protease cair dan diinkubasi dalam shaker waterbath pada suhu 37 C, 120 rpm sampai substrat habis. Larutan hasil produksi enzim protease disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan merupakan enzim protease kasar. Supernatan (enzim kasar) ini kemudian diuji aktivitas (Sigma, 1999) dan kadar protein (Bradford, 1976). Pemurnian Enzim Protease (El-safey dan Raouf, 2004) Enzim protease dimurnikan dengan menggunakan metode pengendapan amonium sulfat. 500 ml ekstrak kasar 150

3 enzim protease ditambahkan amonium sulfat 50%. Penambahan tersebut disertai dengan pengadukan pada suhu ± 4 C selama semalam. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm pada suhu 4 C selama 15 menit. Supernatan dibuang dan endapannya merupakan enzim setengah murni. Enzim tersebut kemudian didialisis dengan menambahkan buffer fosfat ph 7 dan dimasukkan ke dalam kantong selofan. Kemudian direndam dalam buffer fosfat M ph 7 dan diaduk menggunakan stirrer pada suhu ± 4 C selama satu malam. Buffer perendam diganti setiap 6 jam sekali sampai semua garam terpisah. Dialisis dihentikan bila semua garam amonium sulfat telah keluar dari membran dengan mengujinya menggunakan larutan BaCl 2 dan HCl. Tiga tetes BaCl M dan 3 tetes HCl 0.1 M ditambahkan ke dalam larutan buffer yang ada di luar kantung selofan. Ion-ion 2- sulfat (SO 4 ) akan membentuk endapan putih BaSO 4 (Sundin, 2008). Larutan enzim semi murni selanjutnya diuji aktivitas dan kadar proteinnya. Karakterisasi Enzim (Schomburg, 1990) Karakterisasi enzim protease meliputi ph, suhu optimum serta K M. Penentuan ph optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim protease setengah murni pada ph yaitu pada 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8, dan 8.5 sedangkan untuk penentuan suhu optimum digunakan variasi suhu pada 25, 30, 37, 40, 45, dan 50 C. Penentuan suhu ini menggunakan interval 5 ⁰C, namun suhu 37 ⁰C juga digunakan karena merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan mikroba. Penentuan K M dilakukan dengan menguji aktivitas enzim protease semi murni pada konsentrasi substrat kasein 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 dan 0.65%. Penentuan berat molekul dilakukan dengan menggunakan metode Sodium Dodesil Sulfat Poliakrilamid Gel Elektroforesis (SDS-PAGE), lalu untuk mengkonfirmasi pita protein aktif yang mempunyai aktivitas protease menggunakan metode zimogram (activity staining method). Dalam penelitian ini digunakan SDS-PAGE diskontinyu dengan stacking gel 3% dan separating gel 12.5% (Laemmli, 1970). Untuk zimogram konsentrasi gel sama, namun terdapat penambahan kasein 0.05% ke dalam separating gel (Mehzard et al., 2005). HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan Skrining Isolat Bakteri Penghasil Protease Berdasarkan hasil isolasi, diperoleh 30 isolat bakteri yang berpotensi sebagai bakteri penghasil protease. Kemudian skrining dilakukan terhadap 30 isolat dengan metode kualitatif (pembentukan zona bening) dan kuantitatif (aktivitas enzim). Hasil skrining diperoleh satu isolat, LnA4, dengan zona bening lebar (diameter 10 mm) dan aktivitas spesifik tertinggi (0.123 U/mg). Hasil identifikasi menunjukkan bahwa isolat LnA4 mempunyai bentuk koloni bulat, bentuk tepi halus, elevasi cembung, warna koloni putih susu, bentuk sel batang dan merupakan bakteri gram positif dan katalase positif. Produksi dan Purifikasi Parsial Enzim Protease Produksi enzim dilakukan pada jam ke-17 hingga ke-18 (akhir fase log) dimana pada jam tersebut isolat LnA4 menghasilkan jumlah enzim protease yang optimum. Isolasi enzim protease kasar dari isolat LnA4 dilakukan dengan sentrifugasi pada suhu 4 C. Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan sel bakteri dengan ekstrak enzim kasar protease. Selanjutnya ekstrak kasar enzim protease dipurifikasi secara parsial dengan metode pengendapan amonium sulfat dan dialisis. Konsentrasi amonium sulfat yang digunakan pada penelitian ini adalah konsentrasi 50%. Tabel 1 menyajikan pengendapan amonium sulfat pada konsentrasi 30-70%. Tabel 1 menunjukkan aktivitas spesifik tertinggi diperoleh pada konsentrasi 50% yaitu sebesar 0.34 U/mg. Oleh karena itu pengendapan dengan ammonium sulfat 50% dipilih sebagai konsentrasi yang sesuai untuk pengendapan enzim protease. Setelah protein diendapkan dengan amonium sulfat dan dilarutkan dalam buffer fosfat 0.05 M dan M ph 7.0 selanjutnya dilakukan dialisis untuk menghilangkan garam dan zat terlarut lainnya. Keberadaan residu amonium sulfat maupun molekul-molekul non-protein lainnya akan mengganggu sisi aktif protease dalam mengikat substrat sehingga dapat mempengaruhi aktivitas protease. Aktivitas enzim setelah purifikasi disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. menunjukkan adanya peningkatan aktivitas protease setelah pengendapan ammonium sulfat bila dibandingkan dengan 151

4 Tabel 1. Aktivitas enzim protease pada berbagai konsentrasi amonium sulfat Konsentrasi Amonium sulfat Aktivitas Enzim (U/mL) Kadar Protein (mg) Aktivitas spesifik (U/mg) 30% % % % % Tabel 2. Purifikasi parsial enzim protease isolat LnA4 Tahap pemurnian Volume enzim (ml) Aktivitas enzim (U) Kadar protein (mg) Aktivitas spesifik (U/mg) Yield (%) Tingkat kemurnian Enzim kasar Pengendapan amonium sulfat Dialisis enzim kasarnya. Demikian pula aktivitas spesifiknya meningkat menjadi 1.05 U/mg. Penambahan amonium sulfat menyebabkan protein mengendap dan aktivitas enzim menjadi meningkat karena menurunnya jumlah kontaminan yang menghalangi sisi aktif enzim untuk berikatan dengan substrat. Menurut (Aulanni am, 2005), penambahan amonium sulfat berpengaruh terhadap protein yang terendapkan selama proses pemurnian. Ion-ion garam amonium sulfat akan berkompetisi dengan protein untuk menarik molekul air. Ion-ion garam memiliki kelarutan lebih besar dibandingkan dengan protein sehingga ion garam akan menarik molekul air dari protein enzim. Protein-protein enzim akan berinteraksi membentuk gumpalan dan mengendap. Proses ini dilakukan pada suhu rendah (4 C) sehingga protein akan mengendap tanpa terdenaturasi. Aktivitas enzim setelah proses dialisis menunjukkan peningkatan sampai 2.17 U, dengan aktivitas spesifik tertinggi yaitu 7.13 U/mg. Setelah protein diendapkan dengan amonium sulfat dialisis perlu dilakukan untuk menghilangkan residu garam amonium sulfat dan zat terlarut lainnya. Keberadaan garam amonium sulfat maupun molekul-molekul nonprotein lainnya akan mengganggu sisi aktif protease dalam mengikat substrat sehingga dapat mempengaruhi aktivitas protease. Menurut Sorensen et al. (1999), salah satu cara memisahkan kelebihan garam amonium sulfat adalah melalui dialisis protein. Molekul garam akan berdifusi keluar dari kantung dialisis, karena molekul kecil cenderung berdifusi ke larutan dengan konsentrasi yang lebih rendah. Tabel 2 juga menunjukkan bahwa tingkat kemurnian enzim mengalami peningkatan setelah pengendapan dan dialisis secara berturut-turut yaitu 1.91 kali dan kali dibandingkan nilai aktivitas spesifik enzim kasar. Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa semakin tinggi tingkat kemurnian enzim maka semakin tinggi pula aktivitas spesifik enzim protease. Penentuan ph Optimum Penentuan ph optimum enzim dari isolat LnA4 dilakukan pada kisaran ph 6, 6.5, 7, 7.5, 8, dan 8.5. Pengaruh ph terhadap aktivitas enzim protease dapat dilihat pada Gambar 1. Gambar 1 menunjukkan bahwa aktivitas protease optimum pada ph 7.5. Saat ph optimum, enzim mempunyai konformasi sisi aktif yang sesuai dengan substrat kasein yang menyebabkan terbentuknya kompleks enzim substrat yang maksimal, karena gugus pemberi dan penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada pada tingkat ionisasi yang diinginkan, sehingga menghasilkan produk yang maksimal juga. Kisaran ph optimum protease bervariasi tergantung dari jenis proteasenya, ph optimum protease pada penelitian ini masih berada pada kisaran ph netral. 152

5 Gambar 1. Pengaruh ph terhadap aktivitas enzim protease yang dihasilkan isolat LnA4 ( ) dan Bacillus subtilis ( ) Sedangkan Bacillus subtilis menunjukkan aktivitas protease optimum pada ph 7. Menurut Suhartono (1989), Bacillus subtilis diketahui dapat memproduksi tiga macam enzim protease, yaitu protease asam, netral dan alkali. Enzim protease netral yang berasal dari Bacillus subtilis stabil pada ph dan diinhibisi oleh etilen amin tetraasetat dan mempunyai ph optimum Penelitian lain menunjukkan bahwa protease yang diisolasi dari Bacillus subtilis mempunyai kondisi optimum pada ph 10 (Boominadhan dan Rajakumar, 2009). Penentuan Suhu Optimum Aktivitas katalitik enzim juga dipengaruhi oleh suhu dimana pada suhu rendah reaksi kimia berlangsung lambat dan pada suhu yang lebih tinggi reaksi berlangsung lebih cepat. Penentuan suhu optimum dilakukan pada variasi suhu 25, 30, 37, 40, 45, dan 50 C dengan waktu inkubasi 20 menit dan pada ph 7.5. Pengaruh variasi suhu terhadap aktivitas protease isolat LnA4 ditunjukkan oleh Gambar 2. Gambar 2 menunjukkan aktivitas protease meningkat dengan meningkatnya suhu. Peningkatan aktivitas protease dari isolat LnA4 ini mencapai nilai optimum pada suhu 37 o C. Pada suhu optimum, tumbukan antara enzim dan substrat sangat efektif, sehingga pembentukan kompleks enzimsubstrat semakin mudah dan produk yang terbentuk meningkat (Nelson dan Cox, 2000). Kenaikan suhu tidak lagi meningkatkan aktivitas protease, namun sebaliknya aktivitasnya mengalami penurunan. Pada suhu diatas suhu optimum, akan mempercepat kerusakan pada konformasi gugus aktif enzim sehingga enzim mengalami hambatan dalam berinteraksi dengan substrat dan aktivitas katalitk enzim akan menurun. Suhu optimum dari Bacillus subtilis juga mencapai suhu yang sama yaitu 37 C. Menurut Suhartono, 1989) protease dari Bacillus subtilis memiliki suhu optimum C. Penelitian lain menunjukkan bahwa suhu optimum protease dari Bacillus subtilis adalah 35 C (El-safey dan Raouf, 2004). Penentuan K M Penentuan nilai K M enzim protease dari isolat LnA4 dihitung berdasarkan aktivitas enzim tersebut pada variasi konsentrasi substrat dengan ph optimum yaitu 7.5 dan suhu optimum 37 o C. Berdasarkan hubungan aktivitas enzim dengan konsentrasi substrat diperoleh grafik transformasi Linewaever-Burk (Gambar 3). Gambar 3 menunjukkan grafik transformasi Lineweaver-Burk dari isolat LnA4. Nilai K M dan V Maks ditentukan dengan persamaan y = ax + b dari hasil perhitungan diperoleh b = 1/ V Maks dan a = K M / V Maks sehingga nilai V Maks adalah mg/ ml/menit dan nilai K M adalah mg/ ml. Konstanta Michaelis-Menten (K M ) menunjukkan kon-sentrasi substrat tertentu pada saat enzim mencapai kecepatan maksimum. Menurut Suhartono (1989) harga K M yang tetap untuk keadaan reaksi yang tertentu (ph dan suhu tertentu) merupakan salah satu ukuran yang mencerminkan aktivitas enzim tersebut. Pada penelitian 153

6 Gambar 2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim protease yang dihasilkan isolat LnA4 ( ) dan Bacillus subtilis ( ) Gambar 3. Grafik Linewaever-Burk aktivitas protease dari isolat LnA4 (Harga 1/Vmaks = dan -1/KM = 3.745) ini nilai K M menunjukkan bahwa pada konsentrasi substrat sebesar mg/ ml reaksi berjalan dengan kecepatan setengah kecepatan maksimum. Nilai V maks menunjukkan kecepatan pembentukan kompleks enzim substrat ES sama dengan kecepatan penguraiannya yaitu sebesar mg/ml/menit. Pada Bacillus subtilis nilai V Maks dan K M berturut-turut adalah mg/ml/menit dan mg/ml. Nilai K M isolat LnA mg/ml memiliki nilai K M yang hampir sama dengan nilai K M Bacillus subtilis yaitu mg/ml, demikian juga nilai V maks dari isolat LnA mg/ml/menit memiliki nilai yang hampir sama dengan nilai V maks dari Bacillus subtilis yaitu mg/ml/menit. Harga K M yang makin rendah menunjukkkan bahwa enzim tersebut makin reaktif (memiliki afinitas yang tinggi) sehingga juga mempunyai V maks yang lebih tinggi. Menurut Aulanni am (2005) bahwa suatu harga K M yang rendah menunjukkan aktivitas enzim yang tinggi terhadap substrat. Sebaliknya harga K M yang besar menunjukkan enzim mempunyai aktivitas rendah terhadap substrat. Penentuan Berat Molekul Penentuan berat molekul enzim protease dilakukan dengan menggunakan SDS-PAGE dan dikonfirmasi dengan zimogram. Berdasarkan hasil perhitungan, diperoleh 4 pita protein dari isolat LnA4 154

7 Gambar 4. Hasil elektroforesis enzim protease isolat LnA4. (M) marker protein, (a) enzim protease hasil dialisis, (b) Zimogram enzim protease dengan BM = kda yang memiliki berat molekul sebesar 73.96, 53.70, 36.70, dan kda (Gambar 4). Dari empat pita protein yang diperoleh belum diketahui apakah semuanya memiliki aktivitas protease. Oleh karena itu digunakan zimogram untuk mengkonfirmasi pita aktif yang memiliki aktivitas Berdasarkan hasil zimogram (Gambar 4a dan 4b) dapat diketahui bahwa hanya ada satu pita protein yang menunjukkan aktivitas protease yaitu pada berat molekul kda. Adanya aktivitas protease pada zimogram ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening. Daerah yang membentuk zona bening merupakan daerah substrat kasein yang telah didegradasi oleh enzim protease. Menurut Mehzard et al. (2005), zat warna Coomassie Brilliant Blue G250 (CBBG) akan berikatan dengan protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (Tirosin) membentuk komplek warna biru. Gel SDS-poliakrilamid berkopolimerisasi dengan kasein membentuk zona bening akibat didegradasi oleh enzim protease. SIMPULAN Hasil isolasi bakteri penghasil protease dari limbah cair tahu tertinggi yaitu isolat LnA4 yang merupakan bakteri Gram positif, katalase positif dan mempunyai sel yang berbentuk batang. Hasil purifikasi parsial enzim yang diendapkan dengan ammonium sulfat mempunyai nilai aktivitas spesifik enzim 7.13 U/mg dengan tingkat kemurnian kali dibandingkan enzim kasar. Enzim protease memiliki aktivitas optimum pada ph 7.5 dan suhu 37 C. Nilai K M adalah mg/ ml dan nilai V maks adalah mg/ml/ menit. Hasil elektroforesis SDS-PAGE dan zimogram menunjukkan bahwa protein dengan aktivitas protease mempunyai berat molekul kda. DAFTAR PUSTAKA Aulanni am Protein dan Analisisnya. Citra Mentari Group. Malang Bains W Biotechnology From A to Z. Second Edition. Oxford University Press. New York Basrah, Enie dan Supriatna Pembuatan Nata de Soya. BPPIHP. Bogor Bradford MM A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye-binding. Anal Biochem. 72: El-safey EM and Abdul Raouf UM Production, Purification and Characterization of protease enzyme from Bacillus subtilis. Proceeding 155

8 International Conference for Development and the Environment in the Arab world, Assiut University, Assiut, Egypt March. p. 14 Gupta R, Beg QK, and Lorenz P Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications. Appl. Microbiol. and Biotechnol. 59(1):15-32 Gupta A, Roy I, Patel RK, Singh SP, Khare SK and Gupta MN One step purification and characterization of an alkaline protease from haloalkaliphilic Bacillus sp. J. Chromatogr. 1075: Laemmli UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4. Nature. 227(5259): Mehzard J, Desrosier C, Lauzon, Robitaille G, Zhao X, and Lacasse P Zymogram Technique for Proteolitic Assay. J Dairy Sci. 88: Nelson DL, and Cox MM Lehninger Principles of Biochemistry. Third Edition. Worth Publishers. New York Nunes AS and Martins MLL Isolation, Properties and Kinetics of Growth of a Thermophilic Bacillus. Braz. J. Microbiol 32: Rahayu K Isolasi dan Pengujian Aktivitas Enzim. PAU Pangan dan Gizi. Penerbit UGM Press. Yogyakarta Rao MB, Tanksale AM, Mohini SG, and Deshpande VV Molecular and Biotechnological Aspect of Microbial Proteases. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(597) Schomburg DS and Salzmann M Enzyme Handbook 4 Class 3: Hydrolases. Springer. Berlin Sigma, Enzymatic Assay of Proteases. Dilihat 26 Juni < sigmaaldrich.com/etc/medialib/ docs/sigma/enzyme_assay/ proteasecaseinsub.par.000/file.tmp/ prot> Singh J, Batra N, and Sobti CR Serine Alkaline Protease from a Newly Isolated Bacillus sp. SSR1. Proc. Biochem. 36: Sorensen H, Sorensen S, Bjergegaard C, and Michelson S Chromatography and Capillary Electrophoresis in Food Analysis. The Royal Society of Chemistry. Cambridge Suhartono, Enzim dan Bioteknologi. Departemen Pendidikan dan kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Pusat antar Universitas Pangan dan Gizi Institut Pertanian Bogor. Bogor Udandi B and Rajendran R Optimization of Protease Enzyme Production Using Bacillus sp. Isolated from Different Wastes. Botany Research International 2(2):