BAB 3 BAHAN DAN METODE

Transkripsi

1 BAB 3 BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi dan Kandang Unit Hewan Laboratorium, Fakultas Kedokteran Hewan IPB, pada bulan Oktober 2009 sampai dengan Juni Hewan Coba dan Pemeliharaannya Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) betina bunting 1 hari, galur Sprague Dawley. Tikus dikandangkan secara individu dalam bak plastik yang berukuran (40x30x15) cm 3 dengan penutup kawat di atas kandang. Kandang dialasi dengan sekam yang diganti 3 hari sekali untuk menjaga kebersihan dan kesehatan. Pemberian minum pada tikus dilakukan ad libitum dan pemberian pakan sesuai perlakuan. 3.3 Metode Penelitian Pembuatan Ekstrak dan Fraksi Daun Katuk Pembuatan simplisia, ekstraksi, dan fraksinasi daun katuk dilakukan seperti cara yang dilakukan oleh Suprayogi et al. (2009) yang dapat dilihat pada Gambar Pembuatan Simplisia Daun katuk segar yang digunakan diperoleh di daerah sekitar Cinangneng, Ciampea Kabupaten Bogor. Daun tersebut dicuci dengan air bersih, kemudian dijemur di bawah sinar matahari sampai layu. Pengeringan dilanjutkan dengan menggunakan oven pada suhu 60ºC selama 12 jam, sehingga dari pengeringan ini diperoleh daun katuk kering Pembuatan Ekstrak Etanol Ekstraksi daun katuk dilakukan dengan metode maserasi. Sebanyak 2 kg simplisia dilarutkan dengan 13 L pelarut etanol (EtOH) di dalam panci stenliss. Campuran tersebut diaduk secara manual dengan pengaduk selama 30 menit dan kemudian didiamkan selama 24 jam. Setelah itu dilakukan penyaringan dengan menggunakan kain flanel dan kertas saring. Filtrat hasil penyaringan ini

2 merupakan ekstrak etanol daun katuk. Kemudian metode yang sama diulang sampai diperoleh larutan ekstrak etanol yang relatif jernih. Ekstrak etanol yang diperoleh dievaporasi menggunakan rotary-evaporator dengan pengaturan temperatur 40ºC. Hasil dari evaporasi ini berupa ekstrak etanol yang kental Pembuatan Fraksi Heksan Ekstraksi dilanjutkan untuk memisahkan senyawa nonpolar menggunakan pelarut heksan. Sebanyak 20 g ekstrak etanol dilarutkan dalam 500 ml pelarut etanol, lalu dimasukkan ke dalam gelas separasi. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan pelarut heksan sebanyak 500 ml. Setelah itu, campuran larutan tersebut dikocok hingga tercampur sempurna, lalu didiamkan beberapa menit sampai terjadi pemisahan antara kedua larutan yaitu larutan heksan pada bagian atas dan larutan etanol pada bagian bawah. Kedua larutan tersebut dikeluarkan dan ditempatkan pada gelas erlenmeyer yang berbeda. Pencampuran dan pengocokan dilakukan berulang hingga larutan yang menggunakan pelarut heksan tampak jernih. Filtrat yang didapat merupakan larutan ekstrak etanol yang telah bebas senyawa nonpolarnya dan larutan fraksi heksan. Kedua larutan yang diperoleh kemudian dievaporasi sehingga diperoleh fraksi etanol yang telah bebas dari senyawa nonpolarnya dan fraksi heksan dalam bentuk kental Pembuatan Fraksi Air dan Fraksi Etil asetat Sebanyak 20 g fraksi etanol yang diperoleh dari fraksinasi sebelumnya dilarutkan dengan air sedikit demi sedikit hingga membentuk larutan fraksi etanol sebanyak 500 ml. Larutan ini dimasukkan ke dalam gelas separasi dan kemudian dicampurkan dengan 500 ml pelarut etil asetat. Larutan tersebut kemudian dikocok hingga tercampur sempurna, kemudian didiamkan selama beberapa menit sampai terjadi pemisahan antara kedua larutan yaitu larutan etil asetat pada bagian atas dan larutan air pada bagian bawah. Kedua larutan tersebut dimasukkan ke dalam gelas erlenmeyer yang berbeda. Pencampuran dan pengocokan dilakukan berulang hingga didapat larutan dengan pelarut etil asetat yang jernih. Filtrat yang didapat kemudian dievaporasikan sehingga didapat fraksi etil asetat dan fraksi air yang kental.

3 Daun Katuk Kering Giling EtOH 13 L Ekstrak Etanol (E-EtOH) Heksan 500 ml Fraksi Hexan (F-H) Aquades 500 ml Fraksi Air (F-H 2 O) EtOH 500 ml Fraksi Etanol Etil asetat 500 ml Fraksi Etil Asetat (F-EtAc) Gambar 3 Prosedur fraksinasi ekstrak daun katuk (Suprayogi et al. 2009) Pembuatan Bubuk Ekstrak dan Fraksi Daun Katuk Ekstrak kental yang diperoleh dari ekstraksi dan fraksinasi dibuat menjadi bentuk bubuk menurut prosedur Suprayogi et al. (2009). Pembuatan bubuk ekstrak dan fraksi dilakukan dengan menambahkan tepung pada masing-masing ekstrak dan fraksi daun katuk. Pencampuran dilakukan secara merata, sehingga diperoleh konsistensi bubuk ekstrak dan fraksi yang sama. Pencampuran ini menghasilkan persentase ekstrak dan fraksi daun katuk sebagai berikut E-EtOH 25%, F-H 13%, F-H 2 O 25%, dan F-EtAc 25%. Bubuk ini penting sebagai persiapan pembuatan pakan Pembuatan dan Pemberian Pakan Pembuatan pakan perlakuan dilakukan menurut prosedur Suprayogi et al. (2009). Pakan yang diberikan berbentuk pelet yang dibuat secara manual dengan bahan utama terdiri atas tepung jagung, tepung ikan, bungkil kedelai, premiks, garam, CaCO 3, minyak kelapa dan terigu. Hasil pencampuran bahan-bahan utama ini merupakan pakan kontrol. Untuk pakan perlakuan, bahan utama ini ditambahkan dengan bubuk ekstrak dan fraksi daun katuk yang telah disiapkan sebelumnya. Komposisi nutrisi pakan terdiri dari protein kasar, lemak kasar, dan

4 energi. Persentase ekstrak dan fraksi yang ada di dalam pakan, hasil analisis proksimat pakan serta dosis ekstrak dan fraksi daun katuk yang dikonsumsi tikus disajikan pada Tabel 5. Tabel 5 Konsentrasi ekstrak daun katuk dalam pakan, dosis yang dikonsumsi, dan komposisi nutrisi dalam pakan Konsentrasi Analisa Proksimat Dosis Ekstrak Ekstrak dan dan Fraksi Protein Lemak Kelompok Fraksi Daun Energi Daun Katuk Kasar Kasar Katuk dalam (Kal/100 g) (mg/hari/ekor) (%) (%) Pakan (%) Kontrol 0 20,01 6, E-EtOH 4,53 20,06 6, ,5 F-H 0,87 20,03 6, ,5 F-H 2 O 3,22 20,04 6, F-EtAc 0,45 20,02 6, Suprayogi et al Pelaksanaan Penelitian Pengelompokan Hewan Coba Hewan coba yang digunakan adalah 33 ekor tikus betina yang terdiri dari 30 ekor betina bunting umur 1 hari kebuntingan (H1) dan 3 ekor betina normal yang pernah bunting dan sudah lepas sapih untuk kelompok normal (N). Sebanyak 30 ekor tikus betina bunting dibagi ke dalam 5 kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol (K), kelompok ekstrak etanol (E-EtOH), kelompok fraksi heksan (F-H), kelompok fraksi air (F-H 2 O), dan kelompok fraksi etil asetat (F-EtAc) dengan masing-masing kelompok terdiri dari 6 ekor tikus betina bunting. Tiap kelompok perlakuan dibagi lagi menjadi 2 waktu pengambilan sampel yaitu pada 5 hari postpartus dan 10 hari postpartus Pemberian Pakan Perlakuan dan Pengambilan Sampel Perlakuan diberikan sejak kebuntingan hari pertama sampai hari ke-10 postpartus. Agar jumlah ekstrak dan fraksi daun katuk yang masuk ke dalam tubuh hewan sesuai dengan yang diinginkan maka tikus diberi makan 2 kali sehari (pagi dan sore). Pada pagi hari, tikus diberi pakan kontrol ad libitum, sedangkan sore hari diberi pakan perlakuan sebanyak 5% dari bobot badan. Selama kebuntingan hewan coba dibiarkan tidak terusik hingga hari kelahiran. Bila pada kandang ditemukan anak, maka dilakukan perhitungan jumlah anak yang lahir dan hari tersebut dinyatakan sebagai hari 1 postpartus.

5 Pengambilan sampel uterus dilakukan pada hari ke-5 dan ke-10 postpartus (Gambar 4). Pengambilan sampel uterus dilakukan dengan pembedahan. Sebelum dibedah, tikus dianestesi dengan menggunakan eter. Setelah tikus tersebut mati, bagian abdomen tikus dibuka sampai uterusnya ditemukan. Kemudian uterus tikus diambil dan dibersihkan dari lemak-lemak yang menempel. Setelah itu uterus ditimbang menggunakan timbangan digital. Pemberian pakan perlakuan Masa kebuntingan hari Masa laktasi H1 H20-H21 Hari ke-5 laktasi Hari ke-10 laktasi Hewan masuk, ditimbang Keterangan : BU= bobot uterus BI =bobot induk Penimbangan BI Pembedahan: pengukuran BI, BU Pembedahan: pengukuran BI, BU Gambar 4 Diagram pengambilan data. 3.4 Parameter yang Diukur Parameter yang diukur meliputi bobot induk yang diukur pada hari pertama kebuntingan (H1), jumlah anak yang dilahirkan, bobot induk setelah melahirkan, bobot induk sebelum dibedah pada hari ke-5 dan ke-10 postpartus, serta bobot uterus pada hari ke-5 dan ke-10 postpartus. 3.5 Pengolahan Data Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan Uji Sidik Ragam (ANOVA) dengan Rancangan Acak Lengkap, dan jika terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji lanjut (Duncan Test).