BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Bahan dan Alat Metode Penelitian

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian di tingkat lapangan dilaksanakan di Kebun Percobaan Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatika (BALITTRO) yang terletak di Gunung Putri. Lokasi kebun berada pada ketinggian 1500 m di atas permukaan laut (dpl). Analisis tanah dan jaringan tanaman dilaksanakan di Laboratorium Balai Penelitian Tanah Bogor. Analisis kandungan senyawa asiatiosida dilaksanakan di Laboratorium Pasca Panen BALITTRO. Analisis anatomi daun dilaksanakan di Laboratorium Histologi BIOTROP Bogor. Penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus 2008 sampai dengan Maret Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan terdiri dari bahan tanaman pegagan berasal dari Boyolali (CASI 016), pupuk kandang sapi, batuan fosfat christmas (kandungan P 2 O 5 32%). Bahan tanaman berupa bibit tanaman pegagan diperoleh dari perbanyakan vegetatif dengan umur 4 minggu sejak semai. Alatalat yang digunakan terdiri dari peralatan tanam (cangkul, sekop, ember, pisau, kored, meteran, sprayer), automatic leaf area meter, timbangan kasar, timbangan analitik, oven. Metode Penelitian Percobaan disusun menggunakan rancangan perlakuan Rancangan Petak Terbagi (Split Plot Design). Petak utama adalah dosis pupuk kandang, terdiri dari lima dosis yaitu 0 (tanpa pupuk kandang); 10, 20, 30, 40 t pupuk kandang/ha. Anak petak adalah penggunaan batuan fosfat terdiri dari dua dosis yaitu tanpa batuan fosfat dan 300 kg batuan fosfat/ha. Dari dua faktor perlakuan tersebut diperoleh 10 kombinasi perlakuan dan diulang 5 kali, sehingga diperoleh 50 satuan percobaan.

2 14 Model linier yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: Yijk = μ + β i + P j + ε ij + R k + (PR) jk + ε jk Yijk = pengamatan pada perlakuan dosis pupuk kandang ke-j, dosis batuan fosfat ke-k pada kelompok ke- i μ = rataan umum β i Pj εij R k = pengaruh kelompok ke-i = pengaruh perlakuan pupuk kandang ke-j = galat pada perlakuan pupuk kandang ke-j dan kelompok ke-i = pengaruh perlakuan batuan fosfat ke-k (PR) jk = pengaruh interaksi antara perlakuan pupuk kandang ke-j dan batuan fosfat ke-k ε jk = galat pada perlakuan batuan fosfat ke-k dan interaksi pupuk kandang dengan batuan fosfat ke-jk i = jumlah ulangan : 1, 2, 3, 4, 5 j = jumlah perlakuan petak utama : 1, 2, 3, 4, 5 k = jumlah perlakuan anak petak : 1, 2 Data hasil pengamatan dianalisis menggunakan sidik ragam, uji perbandingan nilai tengah perlakuan menggunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5%. Untuk mengetahui dosis pupuk yang optimal terhadap produksi senyawa bioaktif asiatikosida dan pola respon pegagan dilakukan analisis regresi. Pelaksanaan Percobaan Pembibitan Pembibitan dilakukan menggunakan polybag dengan media campuran tanah dan pupuk kandang perbandingan 2 : 1, ditempatkan pada lokasi yang ternaungi selama 4 minggu. Bibit yang digunakan adalah dari aksesi Boyolali. Bagian tanaman yang diambil untuk calon bibit adalah stolon yang telah berakar pada setiap buku dengan jumlah ruas 1.

3 15 Pengolahan tanah dan penanaman Pengolahan tanah dilakukan untuk mendapatkan struktur tanah yang merata dan gembur, selain itu untuk membersihkan tanah dari gulma dan sisasisa tanaman. Tanah yang sudah diolah kemudian dibuat petakan sebanyak 50 buah dengan ukuran tiap petak 1,6 m x 1,5 m. Jarak antar ulangan 0,6 m, jarak antara petak utama 0,5 m, dan jarak antara anak petak 0,3 m. Pupuk kandang sapi diaplikasikan satu minggu sebelum tanam, batuan fosfat diaplikasikan saat tanam. Bibit pegagan yang telah berumur 4 minggu ditanam dengan jarak tanam 30 cm x 40 cm (20 tanaman/petak). Pemeliharaan tanaman Pemeliharaan tanaman meliputi penyulaman (sampai umur 4 minggu setelah tanam), penyiraman (disesuaikan kondisi lapangan), penyiangan, dan pengendalian hama penyakit. Penyiangan dilakukan secara hati-hati, pada saat penutupan pegagan belum menyeluruh, maka penyiangan dapat dilakukan dengan menggunakan kored, namun saat penutupan sudah menyeluruh maka penyiangan dilakukan secara manual dengan tangan. Pengendalian hama penyakit dilakukan jika telah berada pada ambang batas. Panen dilakukan pada umur 20 MST (minggu setelah tanam). Pengamatan Pengamatan meliputi karakter agronomi (pengamatan pada 5 tanaman sampel yang dipilih secara acak), karakter fisiologi, dan anatomi daun. Sebagai data pendukung dilakukan analisis tanah, pupuk kandang, dan batuan fosfat. Karakter agronomi meliputi: 1. Jumlah daun Pengamatan jumlah daun dilakukan dengan menghitung jumlah daun yang telah terbuka sempurna pada setiap rumpun, pengamatan dilakukan dua minggu sekali. 2. Jumlah stolon Pengamatan jumlah stolon dilakukan dengan menghitung jumlah stolon yang muncul dari setiap rumpun, dilakukan dua minggu sekali.

4 16 3. Panjang stolon Pengamatan panjang stolon dilakukan dengan mengukur panjang stolon terpanjang pada setiap rumpun, diamati setiap dua minggu sekali 4. Persentase penutupan Penutupan tanaman diamati pada umur 20 MST. 5. Indeks Luas Daun (ILD) Pengamatan indeks luas daun dilakukan dengan mengukur luas daun setiap rumpun menggunakan automatic leaf area meter, kemudian dibagi dengan luas total lahan tegakan. 6. Bobot basah Meliputi bobot basah daun, tangkai, stolon, dan akar. Pengukuran dilakukan pada saat panen dengan cara menimbang bobot basah tanaman (g) pada tiap tanaman sampel yang diamati. 7. Bobot kering Meliputi bobot kering daun, tangkai, stolon, dan akar. Pengukuran dilakukan pada saat panen dengan cara menimbang bobot kering (g) pada tiap tanaman sampel yang diamati, setelah dioven pada suhu 60 o C selama 3 hari. 8. Kandungan bioaktif asiatikosida pada simplisia Cara pengambilan sampel daun untuk analisis kandungan asiatikosida adalah sebagai berikut: Ambil daun pada tanaman induk yang sudah terbuka sempurna, waktu pengambilan sampel daun adalah pukul WIB. Potong bagian tangkai daun sehingga diperoleh bagian daun yang bersih dari tangkai daun (Gambar 4). Gambar 4. Sampel daun untuk analisis kandungan asiatikosida

5 17 Sampel daun yang masih dalam keadaan segar segera di bawa ke laboratorium untuk dianalisis. Analisis kandungan bioaktif asiatikosida dilakukan sesuai dengan prosedur pengujian di Laboratorium Pasca Panen BALITTRO sebagai berikut: a. Persiapan contoh Pegagan disortir dan dicuci sampai bersih, dikeringkan dengan blower (suhu 40 o C selama 72 jam). Pegagan kering digiling dan diayak dengan menggunakan ayakan ukuran 40 mesh. Sebanyak 0,2 g serbuk pegagan ditambahkan 25 ml methanol p.a, dikocok di atas alat stirrer plate selama 60 menit, cairan ekstrak tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 50 dan ampasnya diambil untuk diekstrak kembali sampai 3 x masing-masing dengan methanol p.a sebanyak 25 ml. Ekstrak-ekstrak dari ampas tersebut disatukan dengan ekstrak pertama untuk dimasukkan ke dalam labu ukur yang sama kemudian diencerkan dengan methanol p.a dan diimpitkan sampai tanda batas. b. Penetapan contoh Disaring dengan menggunakan kertas saring Whattman no. 42 kemudian disaring kembali dengan kertas saring millipore ukuran 0,2 μm. Disuntikkan ke dalam HPLC (High Performance Liquid Chromatography) sebanyak 20 μl dengan menggunakan fase gerak Asetonitril (CH 3 CN): asam asetat (CH 3 COOH) 0,6% (57:43) dan kecepatan eluen 1ml/menit pada panjang gelombang 258 nm. c. Pembuatan larutan standar Ditimbang dengan teliti ekstrak asiatikosida sebanyak 0,0186 g dengan menggunakan neraca analitis. Dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml untuk diencerkan dengan methanol p.a dan diimpitkan sampai tanda batas. d. Penetapan standar Disuntikkan larutan standar asiatikosida 186 ppm sebanyak 20 μl ke dalam HPLC dengan menggunakan fase gerak Asetonitril (CH 3 CN): asam asetat (CH 3 COOH) 0,6% (57:43), jenis kolom: RP-18 (5 μm) dan kecepatan eluen 1ml/menit pada panjang gelombang 258 nm.

6 18 e. Perhitungan kadar asiatikosida [sp] x [lar std] x fp [std] % Asiatikosida = x 100% Bobot sp x 10 6 Keterangan: [sp] [std] [lar std] fp Bobot sp : konsentrasi contoh : konsentrasi standar : konsentrasi larutan standar : faktor pengenceran : bobot contoh (g) Karakter fisiologi meliput i: 1. Kandungan klorofil Analisis meliputi kandungan klorofil a, klorofil b, total klorofil, dan rasio klorofil a/b. Pengamatan dilakukan di laboratorium RGCI (Research Group of Crop Improvement) Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian IPB, dengan menggunakan metode Sims dan Gamon et al. (2002). Pengamatan dilakukan pada akhir percobaan. Prosedur analisis kandungan klorofil disajikan pada (Lampiran 3). 2. Analisis jaringan tanaman Analisis terhadap kandungan nitrogen (N), fosfor (P), dan kalium (K). Analisis kandungan nitrogen total daun dengan metode Kjedahl (Lampiran 4). Analisis kandungan fosfor dan kalium melalui oksidasi basah dengan HNO 3 dan HClO 4 (Lampiran 5). Untuk analisis kandungan nitrogen dan kalium, sampel daun diambil dari daun ke 4 pada tanaman induk umur 20 MST. Analisis kandungan fosfor, sampel diambil dari daun ke 3 pada tanaman induk umur 20 MST. Analisis dilakukan di Laboratorium Balai Penelitian Tanah Bogor.

7 19 Anatomi daun: (Lampiran 6) Pembuatan preparat anatomi jaringan dengan metode Sass (1951) pada