3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat 3.2 Bahan dan Alat 3.3 Metode Penelitian

Transkripsi

1 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan april hingga Juni 2011 di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku, Laboratorium Biokimia, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Laboratorium Biologi Hewan dan Laboratorium Nutrisi dan Biologi Radiasi, Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor. Laboratorium Mikroteknik dan Anatomi Tumbuhan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. 3.2 Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman genjer (L. flava). Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis histologi daun dan batang genjer, larutan FAA, etanol absolut, TBA, minyak parafin, parafin, xilol, larutan Gifford, etanol 95%, etanol 70%, etanol 50%, etanol 30%, akuades, safranin 2%, dan fast green 0,5%, aniline blue, entellan, Toulidin blue. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk analisis proksimat meliputi akuades, kjeltab jenis selenium, larutan H 2 SO 4, asam borat (H 3 BO 3 ), larutan HCl 10% larutan HCl 0,0947 N, pelarut lemak (n-heksana p.a.), dan larutan AgNO 3 0,10 N. Bahan yang digunakan dalam analisis mineral adalah daun dan tangkai tanaman genjer, KH 2 PO 4, H 2 SO 4, HNO 3, akuades, ammonium molibdat, H 2 NO 3, dan HClO 4. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pisau, cawan porselen timbangan, oven, wadah porselen, tanur, labu soxhlet, labu kjeldahl, alat destilasi, labu erlenmeyer, kertas saring, dan corong Buchner, meja cetak, karton cetak, oven, mikrotom merk Yamator V-240, meja pemanas, gelas obyek, dan rak pewarna. mikroskop cahaya merk Olympus tipe CH20 dan kamera mikroskop merk Olympus DP12. oven, labu takar, labu kjeldahl, alat Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) Novva 300, dan alat spektrofotometri Spektronik Metode Penelitian Penelitian dilakukan dalam beberapa tahap yang terdiri dari tahap analisis histologi daun dan batang genjer, analisis kandungan gizi daun genjer segar dan

2 20 kukus, serta kandungan mineral genjer segar dan khusus. Secara umum tahap penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 5 : Tanaman genjer (L. flava) 1) Pengambilan sample. 2) Pengukuran morfometrik. 3) Analisis histologis daun, batang, dan akar. 4) Analisis kandungan gizi a. kadar air b. protein c. lemak d. kadar abu e. serat kasar 5) analisis kandungan mineral Gambar 5 Diagram alir penelitian Analisis histologi Hal pertama dalam analisis histologis adalah pembuatan preparat tanaman genjer (L. flava) kemudian pengamatan jaringan tanaman dilakukan dengan pengambilan gambar objek pada mikroskop. Pembuatan preparat dilakukan dengan metode paraffin, yang terdiri dari fiksasi, pencucian, dehidrasi dan penjernihan, infiltrasi, penanaman dalam blok, penyayatan, perekatan, dan pewarnaan. Bagian tanaman genjer yang diambil adalah daun, batang atas, batang tengah, batang bawah, dan akar. Fiksasi dilakukan dengan menggunakan larutan FAA, batang dan daun genjer yang telah dipotong kecil dimasukkan ke dalam botol film yang telah berisi larutan FAA dan didiamkan selama > 24 jam (5 hari), setelah itu larutan fiksasi dibuang dan sampel dicuci dengan etanol 50 % sebanyak 4 kali dengan waktu penggantian masing-masing selama 30 menit. Kemudian dilakukan dehidrasi dan penjernihan secara bertahap melalui perendaman dalam larutan seri Johansen I-VII pada suhu ruang dengan perincian : 1. Johansen I selama 2 jam 2. Johansen II selama 24 jam 3. Johansen III selama 2 jam 4. Johansen IV selama 2 jam

3 21 5. Johansen V selama 2 jam 6. Johansen VI (TBA murni) selama 24 jam 7. Johansen VI (TBA murni) selama 2 jam 8. Johansen VI (TBA murni) selama 2 jam 9. Johansen VI (TBA murni) selama 2 jam 10. Johansen VII selama 4 jam Langkah selanjutnya adalah proses infiltrasi atau penyusupan parafin ke dalam jaringan, dengan cara bahan dimasukkan dalam wadah berisi campuran TBA, minyak parafin, serta 1/3 parafin beku dan disimpan pada suhu kamar selama 1-4 jam yang dilanjutkan pengovenan pada suhu 58 0 C selama 18 jam. Pergantian parafin dilakukan setiap 6 jam sekali sebanyak 3 kali pergantian. Setelah itu proses penanaman dilakukan, dengan penggantian parafin dan penyimpanan dalam oven pada suhu ruang selama 1 jam. Setelah parafin mengeras, dilakukan penyayatan dengan mikrotom putar setebal 10 μm. Hasil sayatan kemudian direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi albumin-gliserin dan ditetesi air. Gelas berisi pita parafin kemudian dipanaskan pada hot-plate dengan suhu 45 o C selama 3 sampai 5 jam. Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan safranin 2% dalam air dan fastgreen 0,5% dalam etanol 95%. Pada proses pewarnaan ini gelas obyek direndam ke dalam larutan Xilol 1 dan 2 masing-masing selama 20 menit, dilanjutkan perendaman dalam Etanol absolut, 95%, 70%, 50%, dan 30% masingmasing 5 menit. Setelah itu obyek dibilas dengan akuades dan dimasukkan ke dalam safranin 20% selama satu hari. Pada proses selanjutnya gelas obyek dibilas ke dalam akuades dan dimasukkan ke etanol 30%, 50%, 70%, 95%, dan absolut masing-masing selama 5 menit. Setelah itu obyek dimasukkan ke dalam pewarna fast-green 0,5% selama 30 menit. Gelas obyek kemudian direndam dalam xilol 1 dan xilol 2. Warna yang kontras diperoleh bila merah cemerlang : lignin, kromatin, kutin ; merah muda-merah : kloroplast ; hijau : dinding selulosa dan sitoplasma. Proses pewarnaan diikuti dengan proses penutupan atau pemberian media perekat yaitu entellan atau canada balsam pada gelas obyek dan ditutup dengan gelas penutup dan dikeringkan pada suhu 40 0 C. Setelah itu dilakukan pemberian

4 22 label di sebelah kiri gelas obyek. Proses pemfotoan objek dilakukan dengan mikroskop cahaya Olympus CH20 dan kamera digital merk Olympus DP Analisis kandungan gizi Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia yang terkandung dalam suatu bahan, termasuk di dalamnya analisis kadar air, protein, lemak, abu dan abu tidak larut asam. 1) Analisis kadar air (AOAC 2005) Analisis kadar air yaitu untuk mengetahui kandungan atau jumlah air yang terdapat dalam suatu bahan. Tahap pertama cawan porselen dikeringkan pada suhu 105 o C selama 1 jam dengan menggunakan oven, lalu cawan didinginkan selama 15 menit di dalam desikator kemudian ditimbang. Cawan ditimbang kembali hingga beratnya konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan dan dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 105 o C selama 6 jam atau hingga beratnya konstan. Cawan kemudian dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Kadar air dihitung dengan menggunakan rumus berikut: Perhitungan kadar air pada daun genjer : % Kadar air = B - C x 100% B - A Keterangan : A = Berat cawan kosong (gram) B = Berat cawan dengan daun genjer (gram) C = Berat cawan dengan daun genjer setelah dikeringkan (gram). 2) Analisis kadar lemak (AOAC 2005) Pertama kertas saring dibuat menjadi bentuk selongsong dan kedua ujungnya di tutup dengn kapas. Kemudian Daun genjer seberat 5 gram (W 1 ) dimasukkan ke dalam kertas saring tersebut dan dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W 2 ). Pelarut lemak (n-heksan) dituangkan ke dalam labu lemak kemudian labu lemak dihubungkan dengan soxhlet dan direfluks selama 6 jam sampai pelarut turun kembali ke dalam labu lemak. Sampel dikeluarkan, labu lemak dan soxhlet dipasang kembali lalu didestilasi

5 23 hingga pelarut lemak yang ada dalam labu lemak menguap. Labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 105 o C selama satu jam. Kemudian labu diletakkan dalam desikator untuk didinginkan hingga beratnya konstan (W 3 ). Kadar lemak dapat dihitung dengan rumus berikut: Perhitungan kadar lemak pada daun genjer: % Kadar Lemak = W 3 W 2 x 100% W 1 Keterangan: W 1 = Berat sampel (gram) W 2 = Berat labu lemak kosong (gram) W 3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) 3) Analisis kadar protein (AOAC 2005) Analisis protein yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar pada suatu bahan. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu dekstruksi, destilasi dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode Kjeldahl. (a) Tahap destruksi Daun genjer ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl. Setengah butir kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H 2 SO 4 p.a 98%. Tabung yang berisi larutan tersebut dipanaskan dengan suhu mencapai 400 o C menggunakan alat pemanas. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening. (b) Tahap destilasi Hasil destruksi diencerkan dengan akuades hingga 100 ml dengan labu takar. Air dipanaskan sampai mendidih di heater rangkaian alat Kjeldahl. Asam borat sebanyak 25 ml dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Erlenmeyer tersebut kemudian dipasang pada tempatnya (di tempat pengeluaran sampel dan NaOH). Hasil destruksi (larutan sampel) dipipet sebanyak 10 ml dan dimasukkan ke dalam kjeltec. Setelah itu, larutan NaOH 50% sebanyak 10 ml juga dimasukkan ke dalam alat pengujian. Setelah larutan di dalam erlenmeyer yang berisi asam borat berubah warna menjadi biru kehitaman atau hijau toska, erlenmeyer diangkat dan dilakukan proses titrasi.

6 24 (c) Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan pada erlenmeyer berubah warna menjadi pink. Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut: Perhitungan kadar protein pada daun genjer : %N = (S-B) n NHCl x 14 x 100% W x 1000 x 2,5 % Protein = 6,25 x % N Ket : S = Volume titran (ml) B = balanko (0 ml) W = Berat sampel 2,5 = Faktor pengoreksi 4) Analisis kadar abu (AOAC 2005) Cawan pengabuan dipanaskan dalam oven selama 1 jam pada suhu 105 o C hingga kering, kemudian cawan diletakkan dalam desikator untuk didinginkan selama 15 menit, kemudian ditimbang untuk mendapatkan berat yang konstan. Daun genjer sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan lalu cawan tersebut dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 o C selama 6 jam hingga menjadi abu. Cawan didinginkan di dalam desikator lalu ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Kadar abu ditentukan dengan rumus berikut: Perhitungan kadar abu pada daun genjer : % Kadar abu = C - A x 100% B - A Keterangan : A = Berat cawan porselen kosong (gram) B = Berat cawan porselen dengan daun genjer (gram) C = Berat cawan porselen dengan daun genjer kering (gram) 5) Analisis kadar serat kasar (AOAC 1995) Sebanyak 1 gram sample kering dilarutkan dengan 100 ml H 2 SO 4 1,25%, dipanaskan hingga mendidih lalu dilanjutkan dengan destruksi selama 30 menit,

7 25 dan disaring menggunakan kertas saring Whatman (ф: 10 cm) dan dengan bantuan corong Buchner. Residu hasil saringan dibilas dengan 20 sampai 30 ml air mendidih dan dengan 25 ml air sebanyak 3 kali. Residu didestruksi kembali dengan 100 ml NAOH 1,25% selama 30 menit. Lalu disaring dengan cara seperti diatas dan dibilas berturut-turut dengan 25 ml H 2 SO 4 1,25 % mendidih 2,5 ml air sebanyak tiga kali, dan 25 ml alkohol. Residu beserta kertas saring dipindahkan ke cawan porselin dan dikeringkan dalam oven 130 o C selama 2 jam setelah dingin residu beserta cawan porselin ditimbang (A), lalu dimasukkan dalam tanur 600 o C selama 30 menit, didinginkan dan ditimbang kembali (B). Penghitungan kadar serat kasar pada daun genjer % Kadar serat kasar = bobot serat kasar (gram) bobot sampel kering (gram) x 100% Analisis kandungan mineral (a) Pengujian kadar mineral dengan Atomic Absorption Spectrophotometer (Reitz et al. 1987) Sampel sayuran yang akan mengalami pengujian mineral dilakukan proses pengabuan basah terlebih dahulu. Pada proses pengabuan basah, sampel ditimbang sebanyak 1 g, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 150 ml, lalu ke dalam labu ditambahkan 5 ml HNO 3 dan dibiarkan selama 1 jam. Labu ditempatkan di atas hotplate selama ± 4 jam dan ditambahkan 0,4 ml H 2 SO 4 pekat, campuran (HClO 4 dan HNO 3 ) sebanyak 3 tetes, 2 ml akuades dan 0,6 ml HCl pekat. Larutan contoh kemudian diencerkan menjadi 100 ml dalam labu takar. Sejumlah larutan stok standar dari masing-masing mineral diencerkan dengan menggunakan akuades sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang diinginkan. Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merek Novva300 dengan panjang gelombang dari masing-masing jenis mineral. Langkah selanjutnya adalah pengukuran absorbansi atau tinggi puncak standar, blanko dan contoh pada panjang gelombang dan parameter yang sesuai untuk masing-masing mineral dengan spektrofotometer. Setelah diperoleh absorbansi standar, hubungkan antara konsentrasi standar

8 26 (sebagai sumbu y) dengan absorban standar (sebagai sumbu x) sehingga diperoleh kurva standar mineral dengan persamaan garis linier y = ax+b (dimana y: variable terikat ; a: kemiringan gradient ; x: variable bebas ; b: konstanta) yang digunakan untuk perhitungan konsentrasi larutan sampel. Konsentrasi larutan sampel dihitung dengan mengalikan a dengan absorbansi contoh. (b) Pengujian fosfor metode molibdat-vanadat (Apriyantono et al. 1989) Sampel diperlakukan dengan asam nitrat untuk mengubah semua metafosfat dan pirofosfat menjadi ortofosfat. Kemudian sampel diperlakukan dengan asam molibdat dan asam vanadat sehingga ortofosfat yang ada dalam sampel akan bereaksi dengan pereaksi-pereaksi tersebut dan membentuk kompleks asam vanadimolibdifosfat yang berwarna kuning orange dan intensitas warnanya diukur dengan panjang gelombang 660 nm. Sebanyak 20 g ammonium molibdat dilarutkan dalam 400 ml akuades hangat untuk pembuatan perekasi vanadat molibdat. Ammonium vanadat 1 gram ditimbang untuk dilarutkan dalam 300 ml akuades dan didinginkan, secara perlahan-lahan ditambahkan 140 ml asam nitrat pekat, setelah tercampur ditambahkan pereaksi larutan vanadat molibdat dan diencerkan sampai volume 1 l dengan akuades. Pada pembuatan larutan standar, sebanyak 4,394 g KH 2 PO 4 dilarutkan dengan menggunakan akuades sampai 1000 ml untuk mendapatkan konsentrasi fosfor 1000 ppm. Konsentrasi ini kemudian diencerkan dengan akuades untuk mendapatkan konsentrasi standar fosfor yaitu 0, 2, 3, 4, dan 5 ppm. Larutan sampel hasil pengabuan basah diambil sebanyak 10 ml, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. Sebanyak 25 ml pereaksi vanadat molibdat ditambahkan ke dalam sampel tersebut, kemudian diencerkan dengan akuades sampai tanda tera. Selanjutnya didiamkan sampel selama 10 menit, dan diukur absorbansi sampel pada panjang gelombang 660 nm dengan spektrofotometer merek spektronic 20 Milton Company.