3. METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian 3. METODE PENELITIAN Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Mei 2010 sampai Februari 2011, bertempat di laboratorium Bioindustri Teknologi Industri Pertanian IPB dan laboratorium SBRC IPB Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah ubi kayu, S. cerevisiae berupa ragi curah dari pasar bogor, ragi kering Fermipan, kultur koleksi PAU (ATCC 9763) dan IPB Culture Colection (IPBCC ), pupuk NPK, H 2 SO 4 pekat teknis, NH 4 OH 21%, media Yeast Malt Glukose Pepton (YMGP) Alat Peralatan utama yang digunakan di dalam penelitian ini antara lain peralatan gelas, neraca analitik, shaker, hemasitometer, autoklaf, ph universal, brix meter, HPLC, Spektrofotometer UV-Vis, GC, Densitometer, seperangkat alat inokulasi khamir dan seperangkat alat produksi bioetanol skala laboratorium. 3.3 Tahapan Penelitian Tahapan penelitian adalah: 1) persiapan bahan baku, 2) karakterisasi ubi kayu dan hidrolisat, 3) seleksi, 4) adaptasi S. cerevisiae dan 4) produksi etanol (Lampiran 2) Persiapan Bahan Baku Bahan baku yang masih segar dipisahkan kulit ari dengan daging umbinya. Setelah kulit ari bersih daging umbi dicuci untuk membuang kotoran yang masih menempel. Selanjutnya ubi kayu diparut sehingga menjadi bubur ubi kayu Karakterisasi Ubi Kayu Sifat kimia bubur ubi kyu selanjutnya dianalisa dengan analisa proximat (Lampiran 3). Parameter yang diukur antara lain komponen air, abu, lemak protein, serat kasar dan karbohidrat by difference yang ditetapkan menurut metode AOAC

2 20 (1995), sedangkan pati dan komponen serat diukur menurut metode Van Soetst (1963) Hidrolisis Asam dan Karakterisasi Hidrolisat Hidrolisis dalam penelitian ini dilakukan satu tahap menggunakan autoklaf sederhana. Padatan yang digunakan pada saat hidrolisis adalah 18% dengan konsentasi H 2 SO 4 1M (Lampiran 4). Campuran ubi kayu, H 2 SO 4 dan air dihidrolisis selama 15 menit dengan suhu 121 o C. Setelah dihidrolisis, hidrolisat ditambahkan NH 4 OH teknis 21% untuk menaikkan ph hidrolisat menjadi 4-5. Karakterisasi hidrolisat dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui karakteristik hidrolisat dengan analisis gula total dengan metode fenol H 2 SO 4, analisis gula pereduksi dengan metode DNS, furfural dan HMF dengan metode HPLC (Lampiran 3) Seleksi Persiapan Inokulum Perlakuan pendahuluan untuk kelompok ragi kering seperti ragi curah dan Merk F berbeda dengan S. cerevisiae yang berbentuk biakan segar. Adapun perlakuan untuk biakan segar adalah sebagai berikut : Sebanyak 1 ose biakan segar dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer yang berisi 5 ml media YMGP yang telah disterilisasi pada suhu 121 o C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. yang terdiri dari 5g/l ekstrak khamir, 5g/l malt, 40g/l glukosa, 5g/l pepton dan 1L aquadest, Inkubasi dilakukan pada suhu 30 o C selama 48 jam dan di shaker (Arnata 2009). Setelah dibiakkan jumlah populasi akan dihitung dengan metode hitung langsung menggunakan hemasitometer. Isolat ragi kering dihitung tanpa proses penyegaran, namun hanya dilakukan pengenceran serial saja sampai Kuantitas S. cerevisiae (Lampiran 5) yang dimasukkan ke dalam hidrolisat harus seragam untuk menciptakan lingkungan yang homogen Seleksi Toleransi Galur S. cerevisiae terhadap Hidrolisat Asam Tujuan penelitian ini adalah untuk menyeleksi beberapa galur S. cerevisiae, yang paling toleran terhadap hidrolisat asam ubi kayu. Sebelum digunakan, hidrolisat disaring dengan kertas saring dan pompa vakum sehingga terpisah padatan dan cairannya. Cairan tersebut digunakan untuk media fermentasi (Martin et al. 2007).

3 21 Selanjutnya kedalam hidrolisat ditambahkan masing-masing satu galur S. cerevisiae dengan populasi yang sama. S. cerevisiae kering galur F dijadikan acuan jumlah galur yang lainnya. Starter 0,23% gula awal dan NPK 0,06% gula awal (Arnata 2009) ditambahkan ke dalam hidrolisat. Campuran hidrolisat diinkubasi di dalam labu erlenmeyer 250 ml menggunakan orbital shaker 128 rpm selama 24 jam pertama. Labu erlenmeyer ditutup dengan sumbat karet dan labu leher angsa secara aseptis. Total waktu inkubasi selama 72 jam. Pengamatan dilakukan setiap 12 jam terhadap total gula, gula pereduksi, dan etanol yang terbentuk pada akhir fermentasi (Lampiran 6). Parameter yang diukur dan dihitung sebagai indikator kinerja proses seleksi toleransi galur S. cerevisiae terhadap hidrolisat asam adalah : 1. Substrat awal berupa gula total (So) 2. Sisa substrat setiap 12 jam 3. Kadar etanol sebagai produk (P) 4. % Efisiensi pemakaian substrat ((S0-S)/S0) 5. % Efisiensi fermentasi (P/P teoritis) 6. % Rendemen etanol (Y p/s ) Galur yang toleran adalah galur yang menunjukkan efisiensi pemanfaatan substrat, efisiensi fermentasi dan rendemen etanol (Lampiran 6) tertinggi. Galur yang paling toleran digunakan untuk penelitian selanjutnya Seleksi Total Gula Awal dan Dosis Starter Terbaik Pada penetuan ini fermentasi hidrolisat asam ditetapkan kadar gula dan dosis starter minimum yang paling efektif bagi galur terpilih. Keadaan fermentasi sama seperti seleksi toleransi galur, namun jumlah gula yang dimasukkan adalah 15%, 18%, 20% dan 24%. Dosis starter yang dimasukkan adalah 1x, 2x dan 3x (0,23% gula awal). Pengamatan yang dilakukan adalah jumlah total gula pada awal dan akhir fermentasi, serta etanol yang terbentuk pada akhir fermentasi. Parameter yang diukur dan dihitung sebagai indikator kinerja proses seleksi total gula awal dan dosis starter terbaik adalah : 1. Substrat awal berupa gula total (So)

4 22 2. Sisa substrat pada akhir fermentasi 3. Kadar etanol sebagai produk (P) 4. % Efisiensi pemakaian substrat ((S0-S)/S0) 5. % Efisiensi permentasi (P/P teoritis) 6. % Rendemen etanol terhadap total gula (Y p/s ) Kadar gula dan dosis starter yang menghasilkan etanol terbanyak akan digunakan pada proses selanjutnya Adaptasi S. cerevisiae terhadap Hidrolisat Asam Prosedur adaptasi menggunakan metode batch. Dosis starter terpilih dimasukkan ke dalam 250 ml labu erlenmeyer yang berisi 100% hidrolisat (kultur sel 1). Setaah 72 jam, starter sejumlah dosis terpilih dikeluarkan dengan pipet kemudian dimasukkan kembali ke kultur sel 2. Penambahan starter ke dalam hidrolisat baru diulang 9x. Pengamatan jumlah biomassa, kadar etanol, total gula, gula pereduksi, HMF dan furfural (Lampiran 3). Pengamatan dilakukan setiap 72 jam. Parameter yang diukur dan dihitung sebagai indikator kinerja proses adaptasi S. cerevisiae terhadap hidrolisat asam adalah : 1. Konsumsi gula total (S 0- S) 2. Kadar etanol sebagai produk (P) 3. Laju pertumbuhan spesifif (µ= bobot biomassa/72 jam) 4. % Penurunan HMF ((H 0 -H)/H 0 ) 5. % Penurunan Furfural ((F 0 -F)/F 0 ) 6. % Efisiensi pemakaian substrat ((S 0 -S)/S 0 ) 7. % Efisiensi fermentasi (P/P teoritis) 8. % Rendemen etanol terhadap total gula(y p/s ) 10 % Rendemen bobot biomassa terhadap total gula (Y x/s ) Kondisi adaptasi dengan µ dan etanol tertinggi akan digunakan untuk proses selanjutnya.

5 Produksi Bioetanol Proses ini merupakan proses verifikasi terhadap galur yang adaptif. Proses ini dilakukan dengan membandingkan kemampuan galur yang telah adaptif dengan kontrol yaitu strain yang tidak adaptif dalam menghasilkan etanol. Isolat yang adaptif dan kontrol di masukkan ke dalam 300 ml hidrolisat asam untuk proses fermentasi selama 96 jam pada suhu ruang dan agitasi 128 rpm untuk 24 jam pertama. Parameter yang diukur dan dihitung sebagai indikator kinerja proses produksi etanol adalah : 1. Konsumsi gula total (S 0- S) 2. Kadar etanol sebagai produk (P) 3. biomassa (x 0- x) 4. % Efisiensi pemakaian substrat ((S 0 -S)/S 0 ) 5. % Efisiensi fermentasi (P/P teoritis) 6. % Rendemen etanol terhadap total gula(y p/s ) 7. % Rendemen bobot biomassa terhadap total gula (Y x/s ) 3.4. Teknik Analisis Data Seleksi Toleransi Galur S. cerevisiae terhadap Hidrolisat Untuk mengetahui pengaruh hidrolisat asam terhadap kinerja S. cerevisiae dilakukan uji F dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktor tunggal. Faktor yang mempengaruhi adalah 4 sumber galur yaitu ragi curah (s1), merk F (s2), koleksi PAU (s3) dan koleksi IPBCC(s4). Percobaan diulang 2x. Apabila ada salah satu perlakukan berpengaruh nyata maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan (Gomez dan Gomez 1995). Parameter yang diuji adalah jumlal gula total yang digunakan, gula reduksi yang digunakan, etanol yang terbentuk, efisiensi fermentasi, efisiensi substrat dan rendemen etanol. Persamaan model rancangannya sebagai berikut : Yij = µ+ si + ε(ij) Yij = variabel respon karena pengaruh taraf ke i faktor S, pengamatan/unit perlakuan ke n µ = pengaruh rata-rata yang sebenarnya (nilai konstan) si = pengaruh sebenarnya dari taraf ke i faktor s

6 24 ε(ij) = pengaruh sebenarnya unit eksperimen ke i disebabkan oleh kombinasi perlakuan (ij). i = taraf galur (1, 2, 3 dan 4) j = taraf ulangan (1dan 2) Seleksi Total Gula Awal dan Dosis Starter Terbaik Untuk mengetahui pengaruh Jumlah gula dan dosis starter terhadap proses fermentasi dilakukan uji F dengan RAL dua faktor. Faktor yang mempengaruhi adalah gula awal sebanyak empat taraf yaitu 15% (g1), 18% (g2), 20%(g3) dan 24%(g4). Percobaan diulang sebanyak 2x. Faktor kedua adalah dosis agen fermentasi sebanyak tiga taraf yaitu 1kali (d1), 2 kali (d2) dan 3 kali (d3). Apabila ada salah satu perlakukan atau interaksinya berpengaruh nyata maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan (Gomez dan Gomez 1995). Parameter yang diuji adalah adalah jumlal gula total yang digunakan etanol yang terbentuk, efisiensi fermentasi, efisiensi substrat, dan rendemen etanol. Persamaan model rancangannya sebagai berikut : Y ikj = µ+ g i + d i + (gd) ij + ε (ijk) Y ijk = variabel respon karena pengaruh taraf ke-i faktor g dan taraf ke-j faktor d µ = pengaruh rata-rata yang sebenarnya (nilai konstan) = pengaruh sebenarnya dari taraf ke i faktor g g i d j = pengaruh sebenarnya dari taraf ke J faktor d ε (ijk) = pengaruh sebenarnya unit eksperimen ke-ki disebabkan oleh kombinasi perlakuan (ij). i = taraf jumlah gula (1, 2, 3 dan 4) j = taraf dosis agen fermentasi (1, 2 dan3) k = taraf ulangan (1 dan 2) Adaptasi S. cerevisiae terhadap Hidrolisat Asam Untuk mengetahui pengaruh hidrolisat asam terhadap kinerja S. cerevisiae dilakukan uji F dengan RAL faktor tunggal. Faktor yang mempengaruhi adalah siklus adaptasi yaitu 1x 9x (t1-t9). Percobaan diulang sebanyak 2x. Apabila ada salah satu perlakukan berpengaruh nyata maka dilanjutkan dengan uji Duncan (Gomez dan Gomez 1995). Parameter yang diuji adalah perubahan total gula, perubahan gula

7 25 reduksi, etanol yang terbentuk, jumlah biomassa, efisiensi fermentasi, efisiensi penggunaan substrat, rendemen etanol dan rendemen bobot biomassa (Lampiran 6). Persamaan model rancangannya sebagai berikut : Yij = µ+ ti + ε(ij) Yij = variabel respon karena pengaruh taraf ke i faktor t, pengamatan/unit perlakuan ke n µ = pengaruh rata-rata yang sebenarnya (nilai konstan) ti ε(ij) = pengaruh sebenarnya dari taraf ke i faktor t = pengaruh sebenarnya unit eksperimen ke i disebabkan oleh kombinasi perlakuan (ijkl). i = taraf waktu (1, 2, dan 3) j = taraf ulangan (1 dan 2) Produksi Etanol Untuk mengetahui pengaruh kondisi S. cerevisiae yang telah diadaptasi terhadap proses fermentasi, maka dilakukan uji F dengan RAL faktor tunggal. Faktor yang mempengaruhi adalah kondisi S. cerevisiae sebanyak 2 taraf yaitu Kondisi teradaptasi (A) dan tanpa Adapatasi (NA). Diulang sebanyak 2x. Apabila ada salah satu perlakukan berpengaruh nyata maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan (Gomez dan Gomez 1995). Parameter yang diuji adalah perubahan gula total, etanol yang terbentuk, biomassa, jumlah sel, efisiensi fermentasi, efisiensi substrat, rendemen etanol dan rendemen bobot biomassa (Lampiran 6). Persamaan model rancangannya sebagai berikut : Yij = µ+ ai + ε(ij) Yij = variabel respon karena pengaruh taraf ke i faktor a, pengamatan/unit perlakuan ke n µ = pengaruh rata-rata yang sebenarnya (nilai konstan) ai ε(ij) = pengaruh sebenarnya dari taraf ke i faktor a = pengaruh sebenarnya unit eksperimen ke i disebabkan oleh kombinasi perlakuan (ij). i = taraf kondisi S. cerevisiae (1,2) j = taraf ulangan (1,2)

8 26

9