Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Februari hingga Mei 2018 di. Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Laboratorium Analisis Pangan, Laboratorium

Transkripsi

1 IV. METODE PENELITIAN 4.1. Waktu dan Tempat Percobaan Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Februari hingga Mei 2018 di Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Laboratorium Analisis Pangan, Laboratorium Instrumental dan Laboratorium Kimia dan Biokimia Pangan Fakultas Sains Makanan dan Pemakanan Universiti Malaysia Sabah. 4.2 Bahan dan Alat Percobaan Bahan Percobaan Bahan yang digunakan untuk membuat media tumbuh adalah YG Broth (Yeast Extract Glucose Broth) yang mengandung 15 g/l glukosa, 5.2 g/l K2HPO4, 3.18 g/l KH2PO4, 0,12 g/l MgSO4, 0,5 g/l Yeast Extract dan 0,54 g/l NH4Cl. Stock culture Saccharomyces cerevisiae diperoleh dari Fermipan sedangkan untuk Aspergillus oryzae, Xanthomonas campestris dan Bacillus natto diperoleh dari Laboratorium Bioproses Fakultas Sains Makanan dan Pemakanan Universiti Malaysia Sabah. Bahan-bahan pendukung lainnya yang digunakan untuk ekstraksi adalah larutan HCl 1.0 M, NaOH 1.0 M, larutan CH3COOH 1.0 dan etanol. Larutan yang digunakan untuk analisis adalah larutan fenol 0,5% dan H2SO4 pekat (MERCK). Potato Dextrose Agar (PDA) digunakan untuk pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae dan Aspergillus oryzae sedangkan Nutrient Agar (NA) untuk Xanthomonas campestris dan Bacillus natto 25

2 Alat Percobaan Alat alat yang digunakan dalam pembuatan media tumbuh adalah pisau, baskom, neraca analitik, blender, teko ukur, talenan, botol, dan alumunium foil.alat alat yang digunakan untuk analisis yaitu spatula, sentrifus, labu ukur 25mL, pipet ukur, bulb, stopwatch, cawan petri, sentrifus, ph meter, Incubatorshaker, kertas saring, penangas air, neraca analitik, spatula, oven, cawan alumunium, vortex, Spectrofotomter UV VIS, kuvet, mikroskop dan tabung reaksi. 4.3 Metode Penelitian Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimental yang dianalisis dengan cara deskriptif mengenai karakteristik dan jumlah β-glukan yang diperoleh dari khamir jenis Saccharomyces cerevisiae, kapang jenis Aspergillus oryzae, bakteri jenis Xanthomonas campestris dan Bacillus natto. Percobaan terdiri dari 4 perlakuan dan masing masing dilakukan secara duplo. Perlakuan yang dicobakan adalah sebagai berikut, yaitu : A = Media tumbuh dengan Saccharomyces cerevisiae B = Media tumbuh dengan Aspergillus oryzae C = Media tumbuh dengan Xanthomonas campestris D = Media tumbuh dengan Bacillus natto Metode ini digunakan guna mencari tahu hubungan antara variasi jenis mikroorganisme yang digunakan terhadap kadar glukosa, ph, populasi, biomassa sel, jumlah ß-glukan serta karakteristiknya yang diperoleh dari masing masing media fermentasi. Pertumbuhan diamati dari jam ke-0, 24, 48, 72, 96 dan 120 jam pada setiap media tumbuh.

3 Pelaksanaan Penelitian Pelaksanaan percobaan dilakukan dalam 3 tahap, yaitu : 1. Pembuatan Working Culture dan Perhitungan Isolat Awal 2. Pembuatan Media Tumbuh dan Ekstraksi β-glukan 3. Pengujian optical density (OD), ph dan kadar glukosa serta karakteristiknya dengan Scanning Electron Microscope (SEM) pada setiap media fermentasi Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Xanthomonas campestris dan Bacillus natto Pembuatan Working Culture dan Perhitungan Isolat Awal Working culture dibuat dengan melakukan streak pada agar yang telah dituangkan PDA dan NA di cawan petri dan telah dipadatkan terlebih dahulu dimana mikroorganisme yang ada diambil dari agar miring sebagai stock culture, diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 C pada inkubator. Selanjutnya dilakukan Total Plate Count untuk mengetahui jumlah isolat awal. (Lampiran 1.1) Pembuatan Media Tumbuh dan Ekstraksi β-glukan Masing-masing isolat ditumbuhkan dalam media tumbuh YG (Yeast Extract Glucose) broth yang mengandung 15 g/l glukosa, 5.2 g/l K2HPO4, 3.18 g/l KH2PO4, 0,12 g/l MgSO4, 0,5 g/l Yeast Extract dan 0,54 g/l NH4Cl. Ekstraksi β- glukan dilakukan dengan mengikuti metode Pengkumsri et al. (2017). Sebanyak satu ose dimasukkan ke dalam media tumbuh dan diinkubasi pada suhu 30 o C dengan kecepatan agitasi 200 rpm dan dihitung isolat awalnya dengan metode Total Plate Count (TPC), Pengamatan ph, Optical Density (OD) dan kadar glukosa media dilakukan setiap 24 jam sampai jam 120. Setelah 120 jam media

4 28 pertumbuhan disentrifugasi dengan kecepatan 7500 rpm selama 10 menit pada suhu 4 o C. Pellet disimpan untuk tahap selanjutnya. Sebanyak 15% Pellet (b/v) yang telah didapat dimasukkan ke dalam air distilasi ph 5.0 (disesuaikan dengan 1.0 M HCl) lalu diinkubasikan selama 50 o C selama 48 jam dengan kecepatan agitasi 120 rpm. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 80 o C selama 15 menit dalam waterbath. Kemudian sampel disentrifugasi dengan kecepatan 7500 rpm pada suhu 4 o C selama 10 menit. Pellet dikeringkan di oven pada suhu 60 o C. Lalu disimpan pada 4 o C sampai ke tahap selanjutnya. Sel yang telah diautolisis dicampurkan dengan 5 ml NaOH 1.0 M. Selanjutnya diinkubasi 80 o C selama 2 jam dengan di stirrer. Kemudian sampel disentrifugasi dengan kecepatan 6000 g selama 25 menit pada suhu 4 o C. Pellet yang didapat dilarutkan dalam 5 ml CH3COOH 1.0 M dan diinkubasi kembali pada suhu 80 o C dengan di stirrer selama 2 jam. Pellet lalu disentrifugasi kembali dengan kecepatan 6000g selama 25 menit pada suhu 4 o C. Pellet diambil lalu dicuci dengan aquades steril 3 kali dan dikeringkan dengan freeze dry. Sampel yang didapat dihaluskan dengan mortar sampai didapat bubuk halus dan disimpan dalam suhu - 20 o C (Lampiran 1.2) Penetapan Optical Density Media Tumbuh Pengujian Optical Density dilakukan metode langsung berdasarkan turbiditas dengan pengambilan 1 ml dari media tumbuh, lalu dilakukan pengenceran sampai Optical Density merupakan metode untuk mengetahui jumlah populasi sel melalui absorbansi panjang gelombang. Sampel diukur absorbansi di 600 nm. Pengujian Optical Density setiap pada jam ke-0, 24, 48, 72, 96 dan 120 jam sesuai dengan model Gompertz (Gompertz, 1825) (Lampiran 1.3).

5 Penetapan ph Media Tumbuh Pengujian ph dilakukan pada tiap 24 jam inkubasi, mulai dari jam ke 0, 24, 48, 72,96, dan 120 jam. Pengukuran ph dilakukan dengan mengambil sebanyak 2 ml sampel dan ditaruh dalam wadah guna diukur dengan ph meter yang telah dikalibrasi, kemudian tunggu hasil pengukuran hingga stabil (Lampiran 1.4) Penetapan Kadar Glukosa Media Tumbuh Glukosa merupakan nutrisi yang diperlukan oleh mikroorganisme. Kadar glukosa menunjukkan ada tidaknya pertumbuhan mikroorganisme. Pengujian kadar glukosa ini dilakukan pada tiap 24 jam inkubasi, mulai dari jam ke 0, 24, 48, 72,96, dan 120 jam. Penetapan kadar dilakukan dengan metode Fenol-Sulfat pada Spektrofotometri cahaya tampak di λ 490 nm (Dubois et al, 1956). Tahapan penetapan kadar glukosa media tumbuh adalah sebagai berikut (Lampiran 1.5 dan 1.6). 1. Pembuatan Baku pembanding glukosa Larutan baku pembanding glukosa 1000 bpj (stok) dibuat dari 25 mg glukosa yang ditimbang seksama, dilarutkan dengan air dalam labu tentukur 25 ml. Kemudian dilakukan pengenceran sedemikian sehingga diperoleh konsentrasi glukosa baku pembanding sebesar:10 bpj, 20 bpj, 30 bpj, 40 bpj, 50 bpj, 60 bpj, 70 bpj dan 80 bpj, 90 bpj, 100 bpj. 2. Penetapan Kadar Glukosa Baku Masing-masing sejumlah 1000 μl sampel ditambah 1 ml fenol 5%, dikocok homogen, ditambah 5 ml H2SO4 pekat, didiamkan selama 10 menit, dikocok homogen lalu dipanaskan di atas penangas air mendidih selama 15 menit dan didinginkan. Masing-masing larutan hasil reaksi diukur serapannya

6 30 secara spektrofotometri cahaya tampak pada λ 490 nm, dan dibuat kurva baku pembanding dan persamaan garis regresinya. 3. Penetapan Kadar Glukosa Media Tumbuh Perlakuan ini sama dengan penetapan kadar baku. Hasil pengukuran serapan diekstrapolasi ke persamaan garis regresi baku glukosa untuk memperoleh kadar glukosa dalam larutan uji yang diukur. Dengan memperhitungkan faktor pengenceran pada setiap larutan uji dan bobot kering β-glukan (crude), maka kadar β-glukan ekivalen glukosa dalam masing-masing larutan uji dapat ditetapkan Pengamatan Karakteristik β-glukan oleh SEM β-glukan disiapkan dengan pelapisan Palladium Allu dan ditempelkan pita karbon ke specimen mount. Kemudian disesuaikan dengan tinggi permukaan sampel dan ketinggian permukaan pemegang spesimen. Selanjutnya sampel diperketat dengan penggandeng yang sesuai. Visualisasi dan fotografi sampel dilakukan menggunakan mikroskop JEOL JSM LA Electron pada tegangan percepatan 10 Kv. 4.5 Kriteria Pengamatan Kriteria yang diamati adalah sebagai berikut : 1. Pengujian TPC Isolat Awal (Kusmiati et al, 2007) ; 2. Pengujian yield β-glukan (Pengkumsri et al, 2017)) ;s 3. Penetapan Optical Density Media Tumbuh (Mytilinaios, 2012) ; 4. Penetapan ph Media Tumbuh (Kusmiati et al,2007) ; 5. Penetapan Kadar Glukosa Media Tumbuh (Kusmiati et al,2007) 6. Pengamatan Karakteristik β-glukan dengan SEM (Piotrowska, 2015).