BAB VI PENDETEKSIAN PERUBAHAN SEKUENS DNA PADA KELAPA SAWIT ABNORMAL DENGAN TEKNIK RAPD ABSTRAK

Transkripsi

1 116 BAB VI PENDETEKSIAN PERUBAHAN SEKUENS DNA PADA KELAPA SAWIT ABNORMAL DENGAN TEKNIK RAPD ABSTRAK Jaringan daun kelapa sawit hasil kultur jaringan dibuktikan mengalami hipometilasi, sedangkan jaringan bunga megalami hipermetilasi. Perubahan sekuens DNA genom dapat berdampak pada ketidakstabilan genom melalui aktivitas elemen transposon dan perubahan struktur kromosom. Penelitian bertujuan menguraikan keragaman genetik antara tanaman dengan tingkat abnormalitas berbeda dalam klon yang sama, serta mendapatkan pita berbeda pada masing-masing tanaman. Bahan tanaman berasal dari klon MK 152 dengan tanaman berbuah normal, abnormal berat (AbB) dan abnormal sangat berat 2 (AbSB2 atau AS2). Deteksi perubahan DNA genom dengan teknik Random Amplified polymorphic DNA (RAPD). Hasil penelitian menunjukkan bahwa lima primer (OPC-08, OPD15, W-15, OPC-09 dan SC10-19) dapat mengamplifikasi pola pita polimorfis. Primer OPC-08 dapat membedakan tanaman berbunga normal dan abnormal melalui satu pita berbeda pada tanaman normal berukuran bp. Beberapa pita DNA berbeda terdeteksi oleh empat primer lain pada tanaman berbunga normal, AbB dan SB2 namun pita-pita tersebut tidak konsisten untuk menunjuk pada keabnormalan bunga. Perubahan genetik terjadi diantara tanaman yang berasal dari klon yang sama. Kata kunci : kelapa sawit, kultur jaringan, bunga abnormal, sekuens DNA, metilasi DNA, RAPD PENDAHULUAN Penyediaan bibit dalam jumlah banyak dengan waktu relatif cepat, seragam serta bebas patogen merupakan ciri dari perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan. Kelebihan tersebut menjadi dasar untuk penyediaan bibit unggul kelapa sawit melalui kultur jaringan. Menurut Rival et al. (1996) perbanyakan mikro in vitro yang didasarkan pada embriogenesis somatik telah menghasilkan genotipgenotip kelapa sawit elit selama beberapa tahun. Namun Corley et al. (1986) mengungkapkan proporsi kelapa sawit yang berasal dari embrio somatik memperlihatkan fenotip varian somaklon mantel.

2 117 Lingkungan kultur jaringan menyebabkan gangguan kontrol seluler yang berperan terhadap sejumlah perubahan genomik yang ada pada tanaman kultur jaringan (Phillips et al. 1994). Konsentrasi auksin (NAA) dan sitokinin dalam media kultur mempunyai pengaruh dramatis terhadap timbulnya bunga mantel pada tanaman kelapa sawit (Eeuwens et al. 2002). Induksi embriogenesis somatik pada kelapa sawit menggunakan auksin 2,4-D (2,4-diclorophenoxyacetic acid) dengan konsentrasi sangat tinggi dapat menyebabkan perubahan metilasi. Kinetin telah menunjukkan penyebab ekstensif hipometilasi DNA pada proliferasi kultur eksplan akar wortel (Arnholdt-Schmitt et al. 1991), dan NAA (I-naphthaleneacetic acid) mempunyai pengaruh berlawanan sebagai penyebab hipermetilasi (LoSchiavo et al. 1989). Leroy dan Branchard (2000) mengatakan bahwa perubahan kromosom terjadi dengan frekuensi yang tinggi pada tahap awal kalus atau kultur sel cair sebagai penyebab abnormalitas. Beberapa penelitian yang mengungkapkan bahwa terjadi hipometilasi DNA pada tanaman kelapa sawit berhubungan dengan bunga mantel (Jaligot et al. 2000; Matthes et al. 2001; Kubis et al. 2003). Menurut Costello et al. (2001) hipometilasi domain kromosom spesifik berhubungan dengan ketidakstabilan kromosom yang berkontribusi pada kekacauan domain kromosom dan atau efek dosis gen abnormal akibat kehilangan atau pertambahan fragmen kromosom. Replikasi sekuens heterokromatin tidak lengkap pada pembelahan, berperan untuk jembatan anafase dan selanjutnya pematahan kromosom (Kaeppler et al. 2000). Pematahan kromosom tanpa penyatuan dari fragmen yang patah berperan untuk delesi segmen kromosom, pematahan kromosom diikuti dengan penyatuan ujung yang patah berperan untuk translokasi, inversi, duplikasi dan delesi (Phillips et al. 1994). Tanaman-tanaman kelapa sawit hasil perbanyakan dari kultur jaringan kemungkinan mengalami perubahan sekuens DNA akibat proses kultur. Berdasarkan pada uraian di atas maka diduga perubahan metilasi DNA genom dapat berakibat pada perubahan sekuens DNA dari tanaman kelapa sawit. Hasil penelitian sebelumnya dengan teknik RP-HPLC diperoleh bahwa perubahan metilasi pada jaringan daun dan jaringan bunga tidak berdampak langsung terhadap abnormalitas bunga. Kemungkinan perubahan metilasi dapat

3 118 menyebabkan perubahan sekuens DNA atau mutasi pada tanaman kelapa sawit abnormal. Perubahan status metilasi selain berpengaruh pada tingkat gen, juga secara global pada tingkat kromosom yang akan menghasilkan pola pita DNA yang berbeda. Salah satu teknik molekuler yang dapat mendeteksi perbedaan pada struktur gen maupun kromosom adalah RAPD. Teknik ini meskipun memiliki keterbatasan namun dapat digunakan untuk menunjukkan polimorfis pada pola pita DNA dengan menggunakan primer acak maupun spesifik. Analisis RAPD digunakan secara luas untuk pemetaan genetik, studi taksonomi dan filogenetik beberapa organisme. Gaafar dan Saker ( 2006) mengatakan bahwa teknik RAPD efektif dengan memperlihatkan pola pita yang spesifik pada genotip strawberry hasil perbanyakan mikro sehingga dapat digunakan untuk identifikasi kultivar. Penelitian ini bertujuan (1) menguraikan keragaman genetik antara tanaman dengan tingkat abnormal berbeda dalam klon yang sama, dan (2) mendapatkan pita berbeda antara tanaman berbuah normal dan abnormal. Diharapkan hasil penelitian ini memberikan informasi tentang perubahan sekuens DNA genom kelapa sawit hasil kultur jaringan dalam hubungan dengan morfologi bunga abnormal. BAHAN DAN METODE Bahan Tanaman Penelitian dilaksanakan di SEAMEO BIOTROP Bogor dari bulan Maret 2005 sampai Juni Bahan tanaman kelapa sawit merupakan koleksi Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) berumur 11 tahun di Ciampea- Bogor. Tanaman yang digunakan berasal dari klon MK 152 karena mempunyai beberapa tanaman dengan tipe buah berbeda yaitu tanaman berbuah normal (Nml), abnormal berat (AbB) dan abnormal sangat berat 2 (AbSB2). Bahan tanaman yang digunakan adalah bunga, buah dan daun. Bunga diambil dari tandan buah yang masih terbungkus dalam dua lapis seludang (fase 2 penelitian sebelumnya). Buah muda dengan ciri pangkal buah ke arah bagian tengah berwarna putih kehijauan sedangkan bagian ujung buah berwarna ungu gelap.

4 119 Sedangkan daun diambil dari ubud yang masih muda, berwarna putih dengan tulang daun lunak. Metode Penelitian Persiapan Bahan Tanaman dan Isolasi DNA Bahan tanaman diambil dari lapangan meliputi bunga dan buah yang masih tersusun pada spikelet sedangkan daun dalam bentuk ubud, kemudian bahanbahan tersebut dibungkus dengan koran diberi label dan dimasukan dalam plastik secara terpisah. Persiapan bahan tanaman selanjutnya untuk keperluan isolasi DNA seperti pada BAB V (halaman 81), demikian juga metode isolasi DNA dari jaringan daun, bunga dan buah (halaman 81). Amplifikasi DNA dengan Teknik RAPD Berdasarkan PCR Konsentrasi sampel DNA yang akan digunakan diukur melalui elektroforesis yaitu 1µl DNA ditambah 4 µl ddh20 dan 1 µl loadying dye, dirunning pada 1% gel agarose (BIORON) pada tegangan 65 volt, arus 100 ampere selama 50 menit, dan sebagai marker digunakan 100 ng/µl 1 kb marker DNA (RBC). Selanjutnya gel agarose direndam dalam 1% etiumbromide ± 1 jam dan divisualkan pada Gel logic 2000 Imaging System UV dengan software kodak ID 2.6. Sampel DNA dengan konsentrasi 5 ng/ul (DNA dilarutkan dengan ddh2o steril) digunakan dalam reaksi Polymerase Chain Reaction (PCR). Berdasarkan optimasi diperoleh 15 ng DNA lebih baik dari 25 ng dengan reaksi PCR volume akhir 25 µl (Tabel 6). Umumnya untuk mempermudah pekerjaan Tabel 6. Bahan-bahan untuk satu kali reaksi PCR

5 120 Tabel 7. Primer-primer untuk Teknik RAPD dengan jumlah sampel DNA yang banyak maka dibuat master miks sesuai dengan jumlah sampel. Contoh jika 10 sampel maka dibuat master miks untuk 11 reaksi, kemudian diambil 22 ul dari master miks dimasukan ke tabung PCR yang telah berisi 3 ul DNA. Tabung yang berisi sampel PCR divorteks dan disentrifus sebentar kemudian dimasukan ke mesin thermal cycler atau PCR (GeneAmp PCR System 9700 versi 3.08). Amplifikasi sebanyak 45 siklus dengan tahapan PCR sebagai berikut 94 o C 1 menit kondisi awal, denaturasi 94 o C 1 menit, penempelan primer 36 o C 1 menit, sintesis DNA 72 o C 2 menit, sintesis tambahan 72 o C 4 menit dan akhir dari seluruh siklus dikondisikan pada suhu tetap 4 o C. Sampel DNA hasil PCR sebanyak 15 µl ditambahkan dengan 3 µl loadying dye dan dirunning pada 1.2% gel agarose (AppliChem) pada tegangan listrik 70 volt, arus 100 amper selama 90 menit, kemudian gel agarose direndam dalam 1% etiumbromide selama 1 jam dan divisualisasikan pada gel logic 2000 Imaging System UV dengan software kodak ID 2.6. Amplifikasi DNA dengan teknik RAPD menggunakan 10 primer acak (Tabel 7) yang sebagian besar diacu dari Yuniastuti ( 2004) dapat mengamplifikasi DNA kelapa sawit.