MATERI DAN METODE. Tempat dan Waktu Penelitian. Kondisi Umum Propinsi Banten

Transkripsi

1 MATERI DAN METODE Tempat da Waktu Peelta Peelta terdr dar dua tahap yatu pegambla data ukura-ukura tubuh d lapaga dlajutka dega aalss molekuler d laboratorum. Lokas peelta lapaga dtetuka dega metode purposve samplg yatu Kabupate Padeglag da Lebak. Pegambla data ukura tubuh dlakuka dar Bula September sampa November 008. Idetfkas polmorfsme lokus GH/MspI, GHRH/HaeIII da Pt-/HfI dlakuka d Laboratorum Zoolog, Departeme Bolog Fakultas MIPA IPB dar bula Desember 008 sampa Aprl 009. Kods Umum Props Bate Props Bate terletak pada 5 o o Ltag Selata (LS) da 05 o -06 o Bujur Tmur (BT). Luas wlayah props Bate yatu km. Poss Bate sagat strategs yatu sebaga peghubug jalur perdagaga Sumatera-Jawa. Secara geografs, batas-batas wlayah props Bate adalah sebaga berkut: - Sebelah utara berbatasa dega Laut Jawa - Sebelah barat berbatasa dega Selat Suda - Sebelah selata berbatasa dega Samudera Hda Iklm wlayah Bate dpegaruh oleh Ag Moso da gelombag La Na atau El No. Pada saat musm peghuja (November-Maret) cuaca ddomas oleh ag barat (dar Samudera Hda) yag bergabug dega ag dar Asa yag melewat Laut Ca Selata. Pada musm kemarau (Aprl- Oktober), cuaca ddomas oleh ag tmur yag meyebabka wlayah Bate megalam kekerga yag keras terutama dwlayah baga selata (BPS Bate 008). Kabupate Padeglag Kabupate Padeglag secara geografs terletak atara 6 o ' 7 o 0' Ltag Selata (LS) da atara 04 o o ' Bujur Tmur (BT) dega luas daerah sebesar ha atau 747 km. Topograf wlayah Kabupate

2 Padeglag memlk datara yag sebaga besar merupaka datara redah, yatu d daerah baga tegah da selata, dega varas ketgga atara 0 sampa 778 m d atas permukaa laut (mdpl). Suhu udara mmum da maksmum yag terjad d wlayah Kabupate Padeglag berksar atara.5 o C sampa 7.9 o C dega suhu udara rata-rata utuk datara redah adalah.9 o C, da utuk datara tgg adalah.5 o C (BPS Bate 008). Lokas Peelta: Kecamata Csata Kab. Padeglag Lokas Peelta: Kecamata Cbadak Kab. Lebak Gambar Peta lokas peelta d Provs Bate. Kabupate Lebak Kabupate Lebak memlk luas ha. Kods Topograf Kabupate Lebak bervaras atara datara sampa peguuga dega ketgga atara 0 sampa 00 mdpl d wlayah pata selata, ketgga 0 sampa 500 mdpl d wlayah Lebak tegah, ketgga 50 sampa 000 mdpl lebh d wlayah Lebak tmur dega pucakya Guug Saggabuaa da Guug Halmu. Keadaa suhu rata-rata datara redah mecapa 7.9 o C da d datara tgg 5 o C dega ksara suhu udara atara 4.5 o C sampa 9.9 o C. Rata-rata curah huja dalam kuru waktu 3 tahu terakhr mm/tahu (BPS Bate 008).

3 Pegukura Karakterstk Ukura Tubuh Mater Terak yag dguaka dalam peelta adalah kerbau rawa (swamp buffalo). Jumlah terak yag dguaka sebayak 0 ekor, masg-masg 80 ekor dar Padeglag da ekor dar Lebak. Jumlah sampel terak kerbau meurut umur, jes kelam da asal terak, dsajka pada Tabel. Tabel Sampel terak kerbau meurut umur, jes kelam da asal terak Umur Jes Kelam Padeglag Lebak Jumlah ---(tahu) (ekor)--- - Jata 6 7 Beta Jata 4 8 Beta Jata Beta Jata Beta >5 Jata 3-3 Beta Jumlah 80 0 Peralata yag dguaka dalam peelta adalah togkat ukur da pta ukur dalam satua cetmeter (cm). Metode Data ukura tubuh dperoleh melalu pegukura lagsug d lapaga. Peetua lokas da sampel dlakuka dega metode purpossve samplg. Pada peelta lokas yag dtuju yatu Provs Bate, dega pertmbaga bahwa wlayah telah dtetapka sebaga daerah pegembaga terak kerbau. Sedagka pemlha dua lokas yatu Kabupate Padeglag da Kabupate Lebak juga dlakuka secara purpossve samplg yatu tertuju pada lokas dega kepadata terak kerbau tgg. Kerbau dkelompokka dalam 5 kelompok umur da jes kelam. Peetua umur kerbau berdasarka formas dar peterak da berdasarka pergata gg ser dega krtera meurut Lestar (986) yag dsajka pada Tabel 3.

4 Tabel 3. Krtera peetua umur kerbau berdasarka pergata gg ser Gg Ser Umur (tahu) Belum ada gg tetap (I 0 ) Sepasag gg tetap (I ) Dua pasag gg tetap (I 3 ) 3 Tga pasag gg tetap (I 4 ) 4 Empat pasag gg tetap (I 5 ) >5 Peubah yag Damat Peubah yag damat pada peelta adalah karakterstk feotpe yag ada hubugaya dega sfat kuattatf, dataraya adalah tgg pudak (TP), pajag bada (PB), lgkar dada (LD), dalam dada (DD) da tgg pggul (TPg). Gambar Skema pegukura tubuh kerbau, ) pajag bada, ) tgg pudak, 3) lgkar dada, 4) dalam dada, da 5) tgg pggul. Adapu metode pegukura kelma krtera tersebut adalah:. Tgg pudak (TP) dukur dar permukaa taah sampa ttk tertgg pudak (scapula) dega megguaka togkat ukur dalam satua cm.. Pajag bada (PB) dukur dar sed bahu (humerus) sampa tulag duduk (Tuber sch) dega megguaka togkat ukur dalam satua cm. 3. Lgkar dada (LD) dukur melgkar rogga dada dbelakag sed bahu (Os scapula) megguaka pta ukur dalam satua cm.

5 4. Dalam dada (DD) dukur dar ttk tertgg pudak da tulag dada, dukur dega megguaka togkat ukur, satua dalam cm. 5. Tgg pggul (TPg) dukur dar ttk tertgg pggul secara tegak lurus ke taah, dukur dega megguaka togkat ukur, satua dalam cm. Aalss Data Aalss terhadap data ukura-ukura tubuh kerbau dlakuka secara statstk deskrptf, melput la rataa, smpaga baku da koefse keragama. Formula yag dguaka adalah sebaga berkut (Steel & Torre 993): s ; ; KK s SE s Keteraga : la rataa, ukura ke- dar peubah X, jumlah cotoh terak kerbau yag damat dalam populas, KK koefse keragama, SE stadar eror, da s smpaga baku. Perbadga ukura-ukura tubuh atar da dalam populas kerbau daalss dega megguaka uj-t dega formula sebaga berkut: t h s ( ) +

6 keteraga : t h la hasl uj-t, la rataa sampel dar populas pertama, la rataa sampel dar populas kedua, smpaga baku gabuga, jumlah sampel dar populas pertama, da jumlah sampel dar populas kedua. s Aalss uj-t dlakuka dega batua peragkat luak MINITAB 4. Idetfkas Polmorfsme Ge GH, GHRH da Pt- Mater Sampel Terak Kerbau Sampel terak kerbau yag dguaka utuk aalss keragama lokus GH/MspI, GHRH/HaeIII da Pt-/HfI sebayak 77 ekor yag terdr dar 44 ekor dar Padeglag da 33 ekor dar Lebak. Pegambla sampel dlakuka secara purpossve samplg yatu tertuju pada lokas dega kepadata terak kerbau tgg. Prmer Prmer adalah DNA utas tuggal dega ukura pedek, basaya 8 sampa 5 pb (pasag basa), yag aka meempel pada DNA cetaka pada tempat yag spesfk. Pasaga prmer dguaka utuk megapt sekue DNA target pada reaks PCR. Iformas prmer yag dguaka pada peelta dtujukka pada Tabel 4. Tabel 4 Iformas sekue prmer yag dguaka dalam peelta No Lokus Sekue prmer sumber GH/MspI F : 5 -CCCACGGGCAAGAATGAGGC-3 R : 5 -TGAGGAACTGCAGGGGCCCA-3 Mtra et al. (995) GHRH/ HaeIII 3 Pt/ HfI F : 5 -GTAAGGATGCCAGCTCTGGGT-3 R : 5 -TGCCTGCTCATGATGTCCTGGA-3 F : 5 -AAACCATCATCTCCCTTCTTCTT-3 R : 5 -AATGTACAATGTGCCTTCTTCTG-3 Moody et al (995) Wollard et al (994)

7 Metode Beberapa tahapa yag dlakuka melput pegambla sampel darah, solas DNA, amplfkas ge dega tekk polymerase cha reacto (PCR), geotpg dega tekk restrcto fragmet leght polymorphsms (RFLP), da vsualsas pta DNA. Tahap. Pegambla Sampel Darah Darah dambl dar vea jugulars sektar ml dega megguaka tabug vacutaer berhepar. Sampel darah tersebut selajutya dredam dalam etaol 95% utuk meghdar kerusaka sel-sel darah. Tahap. Isolas DNA Total DNA dsolas megguaka metode feol kloroform (Sambrook et al.989). Sampel darah total yag dsmpa dalam etaol 95% dsetrfugas 3500 rpm selama 5 met. Edapa sel-sel darah yag dperoleh dcuc dega buffer TE sebayak kal. Sektar 00 µl sel-sel darah yag telah bebas dar etaol dsuspeska dega STE sampa volume mecapa 350 µl. Sel-sel darah kemuda dlss dega 0 µl protease K (0 mg/ml) da 40 µl 0% SDS. Campura dkocok pela-pela selama jam pada suhu 55 o C. Pemura DNA dlakuka dega metode feol-kloroform, yatu dega meambahka /0 volume 5 M NaCl, volume laruta feol, da volume kloroform so aml alkohol (4:), kemuda dkocok pela-pela pada suhu ruag selama jam. Fase DNA dpsahka dar fase feol dega setrfugas pada kecepata 7000 rpm selama 5 met. Molekul DNA dedapka dega meambahka /0 volume 5 M NaCl da volume etaol absolut. Edapa DNA yag dhaslka selajutya dcuc dega etaol 70% kemuda dedapka lag dega kecepata 7000 rpm selama 5 met. Ssa etaol dbuag da duapka dega megguaka pompa vakum. DNA selajutya dlarutka dega 80 µl 80% bufer TE. Tahap 3. Amplfkas Ge dega Tekk PCR Tekk PCR dlakuka utuk memperbayak (amplfkas) fragme ge mejad copy ( yatu jumlah sklus PCR yag basaya sklus). Dega

8 perbayaka maka fragme ge target dapat dvsualsaska pada gel elektroforess. Reaks PCR dlakuka dega volume total 5 µl dar campura laruta yag terdr dar 0 sampa 00 g DNA geom, U ezm taq polmerase da 0X buferya (New Eglad Bolab); mm dntp m;.5 mm MgCl da dh O sterl. Sedagka kods reaks PCR dalam mes thermocycler dracag dega suhu pradeaturas 94 o C selama 4 met, selajutya 30 sklus reaks yag terdr dar deaturas 94 o C selama 0 detk, aealg (suhu spesfk prmer) selama met, perpajaga 7 o C selama met. Pemajaga akhr pada suhu 7 o C selama 7 met. Suhu aealg utuk prmer lokus GH/MspI, GHRH/HaeIII, da Pt/HfI secara beruruta yatu 6 o C, 60 o C da 60 o C. Tahap 4. Geotpg Tekk RFLP Produk PCR selajutya dpotog dega ezm restrks yag spesfk dega ge tersebut. Ezm restrks yag dguaka utuk ge GH, GHRH da Pt- secara beruruta yatu MspI, HaeIII da HfI. Ezm restrks MspI megeal stus restrks C*CGG, sedagka ezm restrks HaeIII da HfI masg-masg megeal stus GG*CC da G*ANTC. Kods pemotoga dlakuka meurut produse ezm yatu µl produk PCR dcampur dega sampa ut ezm restrks dalam Bufer (New Eglad Bolabs) da selajutya dkubas pada suhu 37 o C selama mmal 4 jam. Tahap 5. Vsualsas pta DNA Vsualsas pola pta hasl RFLP megguaka elektroforess gel polakrlamd 6% yag dkut dega metode pewaraa perak (slver stag). Gel dbuat dega cara mecampurka ml ar destlata, 4 ml laruta 5 TBE, 4 ml laruta akrlamd 30%, 5 µl laruta TEMED, da 60 µl APS 0%. Sebayak µl produk RFLP dcampur dega + 6 µl loadyg dye (bromthymol blue 0.0%, lee cyaol 0.0 da glserol 50%). Elektroforess dlakuka pada tegaga kosta 00 mvolt selama 40 met. Setelah elektroforess selesa, gel dambl utuk dlakuka pewaraa perak. Tahapa pewaraa perak yatu gel dcuc secara bertahap sebaga berkut: dega laruta CTAB 0. gram/00 ml ar destlata selama 8 met, ar destlata selama met, ml NH 4 OH/00 ml ar destlata selama 6 met, laruta

9 perak trat (AgNO 3 ) selama 0 met da ar destlata selama met. Utuk memuculka pta dalam gel, gel dredam dalam laruta yag terdr atas Na CO 3 da 38% formadehd. Setelah pta mucul, laruta asam asetat dtuagka utuk meghetka aktftas oksdas perak oleh formadehd. Aalss Data Aalss data molekuler lokus GH/MspI, GHRH/HaeIII da Pt-/HfI pada populas kerbau Bate melput frekues alel, kesembaga Hardy- Weberg, la heterosgostas melput heterosgostas pegamata (H o ) da heterosgostas harapa (H e ), da la-la deks fksas melput F IS, F IT da F ST. Frekues Alel Frekues alel utuk setap lokus dhtug berdasarka petujuk Ne (987) dega formula sebaga berkut: + j j Keteraga : frekues alel, jumlah geotpe dar alel ke-, da j jumlah alel ke- terpaut alel ke-j (j ). Kesembaga Hardy-Weberg Kesembaga Hardy-Weberg duj dega ch-square (χ ) meurut Hartl (988), sebaga berkut: χ X Keteraga: χ j ( Obs Ep Ep ) la ch-square, Obs jumlah pegamata geotpe ke-, da Ep jumlah harapa geotpe ke-

10 Nla Heterozgostas Pegamata (H o ) Nla heterosgostas teramat (H o ) da heterosgostas harapa (H e ) dapat dguaka utuk meduga la koefse breedg pada suatu kelompok terak. Perhtuga la H o da H e dlakuka meurut petujuk Hartl (988) dega formula sebaga berkut: Ho H o j N j N, Keteraga : H o heterosgostas pegamata, N j jumlah dvdu heterosgot pada lokus ke-, da N jumlah dvdu yag damat. Nla Heterozgostas Harapa (H e ) He H e P Keteraga : H e heterosgostas harapa, P frekues alel ke- pada lokus ke-, da jumlah alel pada lokus-. Ideks Fksas Nla deks fksas yag dkeal dega uj F-statstk dapat dguaka utuk megetahu sstem perkawa da pola seleks pada populas yag damat. Ideks fksas terdr atas tga parameter yatu F IS, F IT da F ST yag dhtug berdasarka petujuk Ne (987) dega formula sebaga berkut: F IS X,, F IT X F ST

11 Keteraga: X rataa frekues geotpe homosgot, rataa frekues alel yag sama, rataa kuadrat frekues alel, da kuadrat rataa frekues alel. Uj Hubuga Geotpe dega Ukura Tubuh Uj hubuga geotpe dega ukura tubuh kerbau dlakuka dega aalss uj-t. Data ukura-ukura tubuh utuk uj geotpe dkelompokka mejad tga kelompok umur yatu kelompok umur sampa 3 tahu, 4 sampa 5 tahu, da lebh dar 5 tahu. uj-t dlakuka dega batua peragkat luak MINITAB 4. Sebelum dlakuka uj hubuga geotpe dega ukura-ukura tubuh, data ukura tubuh dkoreks terlebh dahulu. Adapu koreks dlakuka melalu dua tahapa koreks. Pertama dlakuka koreks dega patoka kerbau beta umur 4 sampa 5 tahu utuk setap daerah. Kedua, data ukura tubuh kerbau Lebak yag telah terkoreks ke data kerbau beta umur 4 sampa 5 tahu, dkoreks terhadap daerah Padeglag. Koreks data dlakuka dega batua peragkat luak mcrosoft ecel 003. Formula koreks data yag dguaka adalah sebaga berkut: Koreks tahap pertama: X -terkoreks X X Beta umur 4-5 tahu Pegamata X pegamata ke- Koreks tahap kedua: X -terkoreks X Padeglag X Pegamata X pegamata ke-