III BAHAN DAN METODE PENELITIAN. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :

Transkripsi

1 III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1. Bahan dan Peralatan Penelitian Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Daun kemangi (Ocimum sactum L) Daun kemangi yang digunakan dalam penelitian ini berupa daun segar dengan ciri-ciri warna daun hijau tua dan lebar daun kurang lebih 3 cm. 2. Fillet broiler 500 g sebagai sampel bahan yang akan diteliti. Sampel bahan yang akan digunakan yaitu daging fillet broiler yang diambil dari bagian dada. Fillet broiler didapatkan di pasar tradisional Jatinangor, Kabupaten Sumedang, Jawa Barat. 3. Aquades digunakan dalam prosedur pewarnaan gram sebagai pembilas larutan warna. 4. Etanol 96% sebagai pelarut/pengekstrak polar daun kemangi. 5. Lactose Broth sebagai media pembiakan bakteri dari sampel fillet dada ayam. 6. Media Nutrient Agar sebagai media tumbuh bakteri yang akan diamati. - Alkohol 96% 7. NaCl 0,9% sebagai kontrol negatif untuk memastikan alat dan bahan yang digunakan dalam membuat konsentrasi dalam kertas cakram tidak mengandung zat anti bakteri. 8. Spirtus sebagai bahan bakar bunsen.

2 Peralatan Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Autoclave, digunakan untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian dengan menggunakan uap air panas bertekanan tinggi pada 121 C atau lebih. 2. Batang pengaduk, terbuat dari gelas tahan panas yang digunakan untuk mengaduk larutan di dalam alat gelas hingga larutan homogen. 3. Bulb dan pipet ukur 10 ml, digunakan untuk menyedot larutan atau reagen dalam jumlah tertentu secara akurat. 4. Bunsen, digunakan untuk menciptakan kondisi yang steril saat pewarnaan bakteri. 5. Cawan petri, digunakan sebagai wadah untuk pembiakan bakteri. 6. Gelas ukur 250 ml, digunakan untuk mengukur volume cairan. 7. Inkubator, digunakan untuk inkubasi bakteri. (Suhu 37 C) 8. Penggaris, digunakan untuk mengukur diameter zona hambat. 9. Blender digunakan untuk menghaluskan daun kemangi. 10. Evaporator vacuum digunakan untuk mengevaporasi etanol dalam pembuatan ekstrak daun kemangi. 11. Magnetic stirrer digunakan untuk mengaduk larutan dengan kecepatan yang konstan dalam pembuatan ekstraksi daun kemangi. 12. Kertas label, digunakan untuk memudahkan penandaan suatu alat dan bahan. 13. Pisau, digunakan untuk memotong sampel. 14. Talenan, digunakan sebgai alas untuk memotong bahan dan sampel.

3 15. Mortal mortar, digunakan untuk menghaluskan sampel. 16. Tabung durham, digunakan untuk melubangi media nutrient agar dalam pembuatan sumur atau cakram. 17. Tabung Erlenmeyer 1000 ml, digunakan sebagai wadah pembuatan media nutrient agar dan Lactose Broth. 18. Timbangan digital, digunakan untuk menimbang suatu bahan atau sampel Prosedur Penelitian Persiapan Alat Peralatan yang digunakan untuk penelitian, seperti batang pengaduk, pipet, cawan petri, gelas ukur, kertas saring, tabung durham, tabung reaksi, dan Erlenmeyer flask dicuci, kemudian dikeringkan dan disterilisasi kering dalam oven bersuhu 150 C selama 60 menit Persiapan Media Nutrien Agar 1. Nutrient agar ditimbang sebanyak 39 gram, kemudian disimpan dalam gelas Erlenmeyer. 2. Aquades ditambahkan ke dalam gelas Erlenmeyer yang telah berisi nutrient agar hingga 1000 ml. 3. Bahan dipanaskan pada api kecil dan diaduk hingga homogen. 4. Bahan yang sudah homogen dituangkan ke dalam cawan petri steril. 5. Cawan petri yang berisi nutrient agar tersebut disterilisasi dengan metode sterilisasi basah menggunakan autoclave pada suhu 121 C selama 15 menit.

4 Persiapan Larutan Ekstrak Daun Kemangi 1. Mencuci daun kemangi segar hingga bersih dari kotoran yang menempel, kemudian ditiriskan. 2. Menjemur daun kemangi yang telah dibersihkan di bawah sinar matahari. 3. Menimbang daun kemangi yang telah dikeringkan sebanyak 1000 gram kemudian dibagi menjadi dua bagian (masing-masing 500 gram). 4. Menghaluskan daun kemangi yang telah ditimbang menggunakan blender. 5. Melakukan maserasi, yaitu merendam serbuk daun kemangi menggunakan pelarut. Sebagian daun dilarutkan dengan menggunakan aquabides dan sebagian lagi dilarutkan menggunakan etanol 96% sebanyak 1000 ml, kemudian masing-masing diaduk menggunakan magnetic stirrer selama 3 jam dengan kecepatan 400 rpm. Selanjutnya larutan didiamkan selama 3 24 jam. 6. Menyaring hasil maserasi daun kemangi menggunakan kertas saring, kemudian diperas. 7. Memisahkan debris (ampas) daun kemangi dari filtrat. 8. Melakukan maserasi ulang pada debris yang dihasilkan. Cara yang dilakukan sama seperti perendaman sebelumnya. 9. Memisahkan debris dan filtrat dari hasil maserasi kedua. 10. Mencampurkan filtrat yang dihasilkan dari maserasi pertama dan kedua. 11. Mengevaporasi filtrat daun kemangi yang dimaserasi menggunakan etanol menggunakan evaporator vacuum pada suhu 40 C dan tekanan 76 mmhg selama 3 jam untuk membebaskan etanol dari filtrat, sehingga diperoleh ekstrak kemangi warna hijau pekat.

5 Proses Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Daun Kemangi Proses pembuatan konsentrasi esktrak daun kemangi menggunakan rumus dasar berdasarkan volume per volume (v/v). perhitungan volume larutan ekstrak daun kemangi menggunakan rumus sebagai berikut : V 1. C 1 = V₂. C₂ Keterangan : V1 = Volume larutan ekstrak daun kemangi murni (100%) C1 = Konsentrasi larutan ekstrak daun murni (100%) V2 = Volume larutan ekstrak daun kemangi yang diinginkan = Konsetrasi larutan ekstrak daun kemangi yang diinginkan C2 a. Pembuatan konsetrasi 8% diperoleh dengan cara mengambil 8 ml larutan ekstrak daun kemangi murni kemudian ditambahkan aquades sebanyak 100 ml. Hasil ini berdasarkan perhitungan sebagai berikut : V1.C1 =V2.C2 V1. 100% = 100ml. 8% V1 = 800/100 = 8 ml ekstrak daun kemangi b. Pembuatan konsentrasi 10% diperoleh dengan cara mengambil 10 ml larutan ekstrak daun kemangi murni kemudian ditambahkan aquades sebanyak 100 ml. hasil ini berdasarkan perhitungan sebagai berikut : V1.C1 =V2.C2 V1. 100% = 100ml. 10% V1 = 1000/100 = 10 ml ekstrak daun kemangi c. Pembuatan konsentrasi 12% diperoleh dengan cara mengambil 12 ml larutan ekstrak daun kemangi murni kemudian ditambahkan aquades sebanyak 100 ml. hasil ini berdasarkan perhitungan sebagai berikut :

6 V1.C1 =V2.C2 V1. 100% = 100ml. 12% V1 = 1200/100 = 12 ml ekstrak daun kemangi Persiapan Fillet Broiler Fillet broiler dipotong dengan berat yang sama, masing masing seberat 100 gram dan dibuat menjadi 4 potongan, dengan bentuk dadu (potong dadu). Pemotongan dengan bentuk dadu dilakukan dengan tujuan agar seluruh permukaan sampel fillet broiler yang akan digunakan memiliki permukaan yang sama rata, sehingga proses perendaman menjadi efektif Perendaman Filler Broiler a. Fillet broiler diambil sebanyak 100 gram direndam larutan ekstrak daun kemangi dengan konsentrasi 8%, 10%, dan 12% selama 30 menit menggunakan metode Afrianti, b. Filler broiler ditiriskan, kemudian dilakukan pengujian bakteri total dan pengujian daya hambat bakteri Perhitungan Jumlah Bakteri Total pada Fillet Broiler Pengujian jumlah bakteri total pada daging menggunakan metode Total Plate Count dengan menghitung jumlah bakteri total (TPC) adalah jumlah mikroba aerob per millimeter sampel yang ditentukan melalui metode standar. Perlunya dilakukan pengujian jumlah bakteri total untuk mengetahui jumlah bakteri total pada sampel fillet broiler sebelum dan sesudah perendaman esktrak daun kemangi. Proses perhitungan bakteri total menggunakan metode Pour Plate Methode sebagai berikut : 1. Mengerjakan semua proses, peralatan dan bahan secara aseptik.

7 2. Menimbang sampel fillet broiler sebanyak 10 gram menggunakan timbangan digital. 3. Mencincang sampel hingga halus. 4. Menambahkan larutan NaCl fisiologi sebanyak 90 ml ke Erlenmeyer flask di aduk hingga homogen, sehingga didapat pengenceran Memindahkan 1 ml larutan yang berada di tabung Erlenmeyer pengenceran 10-1 menggunakan pipet ke dalam tabung reaksi pengenceran 10 yang telah diberi larutan NaCl sebanyak 9 ml, aduk hingga homogen, sehingga didapat pengenceran pengenceran Pengenceran dilakukan hingga pengenceran Mengambil masing masing 1 ml larutan dari pengenceran -6 menggunakan pipet ke dalam masing masing cawan petri steril. 7. Memasukan Nutrient Agar (NA) pada suhu 45 C sebanyak 15ml. 8. Membungkus cawan petri dengan kertas sampul dan beri label. 9. Memasukan cawan petri dalam keadaan tebalik ke dalam inkubator pada suhu 37 C selama 1x24 jam. 10. Menghitung jumlah mikroorganisme yang tumbuh pada cawan petridish berkisar koloni, dengan rumus: Jumlah Mikroorganisme ( cfu gram ) = Jumlah Koloni Cawan x ( 1 Faktor Pengenceran )

8 Ilustrasi 2. Diagram Alir Pengujian Bakteri Total Pengukuran Zona Hambat yang Dihasilkan oleh Bakteri pada Fillet Broiler Pengukuran daya hambat bakteri terhadap suatu zat dilakukan dengan mengukur zona hambat yang dihasilkan oleh bakteri. Pembuatan kultur bakteri dan perhitungan zona hambat, adalah sebagai berikut: a. Persiapan Lactose Broth 1. Lactose Broth ditimbang sebanyak 13 gram dan disimpan dalam tabung Erlenmeyer. 2. Aquades sebanyak 1000 ml dimasukan dalam Erlenmeyer dengan perlahan dan dihomogenkan di atas nyala api kecil. 3. Setelah homogen, Erlenmeyer ditutup rapat dengan penutup dan disterilisasi dengan menggunakan autoclave dengan suhu 121 C 1 atm selama 15 menit.

9 b. Penanaman Kultur Bakteri 1. Kultur bakteri dari media pertumbuhan bakteri yang berasal dari fillet broiler diinkubasi, dimasukan ke Lactose Broth dan dibiakkan selama 24 jam pada suhu 37 C. 2. Kultur bakteri sebanyak 1 ml dituangkan dalam cawan petri dan sebanyak ±15 ml nutrient agar dengan suhu ± 40 C ditambahkan ke dalamnya. 3. Setelah nutrient agar membeku, buat sumur atau cakram dengan menggunakan tabung durham berdiameter 5 mm. 4. Sumur ditetesi larutan daun kemangi sesuai dengan perlakuan P1, P2, P3 dalam cawan petri yang berbeda sebanyak 1 tetes dan ditutupi dengan kertas saring steril berbentuk bulat. 5. Semua cawan petri diinkubasi dengan suhu 37 C selama 24jam. 6. Diameter zona bening yang terlihat di sekitar kertas saring diukur dengan menggunakan jangka sorong Metode Penelitian Peubah yang diamati Adapun peubah yang diamati dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Zona Hambat Mengidentifikasi daya hambat bakteri terhadap ekstrak daun kemangi melalui pengukuran zona hambat, yaitu zona bening yang terbentuk di sekeliling koloni bakteri (mm). 2. Penurunan Jumlah Bakteri Total Penurunan jumlah bakteri total dihitung melalui perhitungan jumlah bakteri total pada fillet broiler sebelum direndam ekstraksi daun kemangi dikurangi dengan jumlah bakteri total pada fillet broiler setelah dilakukan perendaman ekstrak daun

10 kemangi, kemudian dipersentasekan (%). Berdasarkan SNI 3924: 2009 (BSNI, 2009) bahwa cemaran mikroba karkas ayam maksimal adalah 1x10 6 cfu/gram Rancangan Percobaan dan Analisis Statistik Penelitian ini dilakukan dengan metoda eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap/RAL (Completely Randomized Design) yang terdiri atas tiga perlakuan yaitu P1 = perendaman ekstrak daun kemangi dengan konsentrasi 8%, P2 = perendaman ekstrak daun kemangi dengan konsentrasi 10%, dan P3 = perendaman ekstrak daun kemangi dengan konsentrasi 12%, masing perlakuan diulang sebanyak enam kali. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan Analisis Ragam (Gasperz,1991) dengan model matematika yang digunakan sebagai berikut : Yij = μ + α i + ε ij Keterangan : Yij : Respon atau nilai pengamatan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j μ : Nilai tengah umum (rata-rata) α i : Pengaruh perendaman ke-i (8%, 10% dan 12%) ε ij : Galat percobaan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j i : Percobaan ke-i (1,2,3) j : Ulangan ke-j (1,2,3,4,5,6) Hipotesis yang akan diuji adalah : H0: P2 P1 ; P2 P3, artinya persentase penurunan jumlah bakteri daya daya hambat pada P2 (10%) lebih kecil atau sama dengan P1 (8%) dan P3 (12%) H1: P2 > P1 ; P2 > P3, artinya persentase penurunan jumlah bakteri dan daya hambat lebih besar diberikan oleh P2 (10%), daripada P1 (8%) dan P3 (12%)

11 Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan menggunakan tabel sidik ragam seperti yang tertera pada Tabel 1. Tabel 1. Daftar Sidik Ragam Sumber Keragaman Db JK KT Fhit F tabel 0,05 Perlakuan (P) (P-1) = 2 JKP KTP KTP KTG Galat (G) P(U-1) = 15 JKG KTG Total (U.P-1) = 17 JKT - Keterangan : DB : Derajat bebas JK : Jumlah kuadrat KT : Kuadrat tengah G : Galat P : Perlakuan (P1, P2, P3) U : Ulangan (U1, U2, U3, U4, U5,U6)

12 33 Kaidah keputusan Jika Fhitung Ftabel 0,05 artinya tidak berbeda nyata (non significant), terima H0 dan tolak H1. Jika Fhitung > Ftabel 0,05 artinya berbeda nyata (significant), tolak H0 dan terima H1. Selanjutnya untuk menentukan apakah selisih rata rata perlakuan berbeda atau tidak maka digunakan Uji Tukey (Honestly Significant Difference) dengan rumus sebagai berikut : HSD = qα (p,fe) Sȳ Keterangan : HSD qα p fe Sȳ KTG U d Kaidah keputusan : Sȳ = KTG U : Honestly Significant Difference : Nilai Tabel untuk Uji Tukey : Jumlah perlakuan : Derajat bebas galat : Galat baku nilai tengah : Kuadrat Tengah Galat : Banyaknya ulangan : selisih rata rata antar perlakuan Jika d HSD0,05, maka tidak berbeda nyata Jika d > HSD0,05, maka berbeda nyata Uji Polinomial Ortogonal dilakukan untuk mengetahui gambaran secara umum kecenderungan terjadinya peningkatan ataupun penurunan respon akibat

13 34 perlakuan yang diberikan, hubungan fungsional antara peragam (Variabel) bebas y dan peragam tak bebas x secara polinomial (Hanafiah, 2010), Dinyatakan dengan rumus : Keterangan : Y = α + β1x + β2x βnx n α β1 y x : intersepsi : (i = 1,2,,n) = koefisien regresi parsial yang berasosiasi dengan derajat polinomial ke I sampai ke n : respon : perlakuan Koefisien pembanding (Guilford dan Frunchter, 1978) disusun untuk mengetahui apakah setiap perlakuan saling orthogonal atau tidak. Perhitungan dengan daftar sidik ragam dilakukan untuk melihat pola kecenderungan, apakah meningkat atau menurun serta untuk menentukan persamaan garis berbeda nyata.

14 35 Tabel 2. Daftar Sidik Ragam Polinomial Ortogonal Sumber Keragaman DB JK KT Fhit F tabel Perlakuan (P) (P-1) = 2 JKP KTP KTP/KTG 0,05 Linier - Kuadratik - Kubik JKLinier JKKuadratik JKKubik KTLinier KTKuadratik KTKubik KT linier/ktg KT kuadratik/ktg KT kubik/ktg Galat (U.P1)=15 JKG KTG Total PU-1=17 JKT Sumber : Gaspersz (1991) Apabila hasil analisis menunjukan signifikan selanjutnya akan dicari model persamaan regresi yang terbaik, untuk kemudian dapat dibuat dalam bentuk kurva.

15 36 Tata letak percobaan dilakukan seperti ilustrasi sebagai berikut : P2 P1 P3 P3 P2 P P1 P3 P2 P1 P3 P P2 P1 P2 P3 P1 P3 Ilustrasi 3. Tata Letak Percobaan Keterangan : P1 : Perendaman dalam ekstrak daun kemangi konsentrasi 8% P2 : Perendaman dalam ekstrak daun kemangi konsentrasi 10% P3 : Perendaman dalam ekstrak daun kemangi konsentrasi 12%